本プロトコールは、麻酔ブタにおける一般的な腓骨神経の電気刺激を介して得られたin vivoトルクデータの評価および解釈に関する簡潔な実験的詳細を記載する。
骨格筋力の信頼できる評価は、神経筋および筋骨格系疾患および傷害研究において、特に再生療法の有効性を評価する際に、おそらく最も重要な転帰尺度である。さらに、多くの再生療法を翻訳する上で重要な側面は、大型動物モデルにおけるスケーラビリティと有効性の実証です。基礎科学研究において、主に小動物モデルにおいて、内因性筋機能特性を評価するために、様々な生理学的調製物が確立されている。この慣行は、in vitro (孤立した繊維、繊維束、または筋肉全体)、 in situ (無傷の血管新生および神経支配を有するが、力伝達器に取り付けられた遠位腱を有する筋肉)、および in vivo (筋肉または筋肉単位の構造は無傷のままである)。これらの準備のそれぞれに長所と短所があります。しかし、 in vivo 強度試験の明確な利点は、同じ動物で繰り返し測定を行うことができることです。本明細書には、麻酔ブタにおける標準的な腓骨電気刺激に応答して インビボで 後肢背屈筋によって産生される等尺トルクを確実に評価するための材料および方法が提示される。
骨格筋の主な機能は力を生み出すことであり、最終的には呼吸、食事、歩行などの活動が可能になります。骨格筋の機能能力を低下させる状態は、パフォーマンス(職業的またはスポーツ的)、障害、または死の低下につながる可能性があります。例えば、高齢化人口における筋肉量と機能の維持は、生活の質と日常生活の基本的および器械的活動を実行する能力と正の関連があります1,2。そして、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者の筋力低下は、歩行不能および呼吸不全をもたらし、最終的に早期死亡に寄与する3、4、5。したがって、筋力測定は、神経筋疾患または傷害を伴う研究において重要な転帰尺度である。
最大自主アイソメトリックトルクまたはアイソキネティックトルク(および/または疲労指数)は、臨床試験6において機能的能力の指標としてしばしば使用される。動物実験では、麻酔下で電気神経刺激を用いてインビボで同様の測定を行うことができる。特に、in vivo製剤は、筋肉組織、腱、血管系、および神経支配が無傷のままであり、したがって、反復的な機能評価を可能にする低侵襲性である7、8、9、10、11。この調製物は、小型げっ歯類モデルにおいて一般的に使用され、ウサギ12、イヌ13、14、ヒツジ15、およびブタ16、17などの大型動物モデルにおいてより少ない程度で使用される。このような方法論の一般的な使用は、脊髄性筋萎縮症(SMA)の遺伝子操作されたブタ(ブタ)モデルなど、多くのトランスレーショナルリサーチ研究に影響を与える可能性があります18。本明細書には、インビボでのブタ背筋群の神経刺激誘発最大等尺トルクを評価する方法が提示されている。提示された技術は、当初、マウス前部股関節筋トルク19,20を評価するために最初に開発されたものから適応され、その後、傷害後のトルク生成能力を調査する経験17,21,22,23,24,25,26,27,28を通じて改良された。そして開発中 様々なブタモデルで16。
このプロトコルは、ロードセルと電気刺激器と統合されたコンピュータを必要とする方法論を用いた インビボ アイソメトリックトルク測定を強調しています。ここで提示される方法は、市販の統合豚アイソメトリックフットプレート試験装置、プラットフォーム装置、および対応するソフトウェアを使用する( 材料表を参照)。しかしながら、この方法論は、他の市販またはカスタムメイドのソフトウェア、データ収集装置、および刺激器を使用するように適合させることができる。これらの方法は、手術テーブルのロック、試験プラットフォーム用の同じ高さの第2のロックテーブル、人工呼吸器および監視装置、および体温を維持するための加熱マットまたは他の装置などの標準機器を備えた専用の大型動物手術スイートでの使用を目的としています。
これらの方法を実施するには、1人の熟練した麻酔技術者と2人の研究担当者が機能テストを実行する必要があります。これらの人々は、プラットフォーム装置上の四肢の初期安定化のために一緒に働くでしょう。その後、2人の人員のうちの1人が電極の配置/位置決めを担当し、もう1人がテスト中のコンピュータアプリケーションを担当します。
重要な手順、変更、トラブルシューティング
データの変動性を最小限に抑え、アプローチの成功を最大化するために、次の重要な手順が強調表示されます。
最適な神経刺激
この実験的アプローチは、神経軸索脱分極から始まり、正しい電極配置と最適化された電気刺激に依存しています。骨のランドマークに関連する神経解剖学の死後分析は、テスト中の適切な電極配置を視覚化するのに役立ちます。最大けいれんトルクを獲得することは、神経軸索に送達される適切な電流(ミリアンペア単位、mA)を決定するのに役立ちます。検査開始時に神経刺激を最適化する際に留意すべき2つの値があります:(1)けいれん対破傷風比は〜1:5であり、例えば、〜2N·mのけいれんトルクは10N·m破傷風トルクに対応する(図3)。(2)体重に対する典型的なトルクは、体重1kgあたり約0.3N·mである(図4)。ピーク時のけいれんトルクが低い場合は、電極を取り外して別の配置を試みます。刺激器の設定、BNC接続、電極接続を必ず確認してください。上記のように、関節角度間の四肢の位置決め中に動きが多すぎる場合、収縮の間に電極の再配置が必要になることがあります(図2)。実験的および介入的なアプローチは、これらの値に影響を与える可能性があることに注意してください。
適切な生体力学的アライメント
開始筋肉の長さは筋肉の収縮力(長さと張力の関係)に影響し、筋肉の長さは股関節、膝関節、足首関節の整列に基づいて変化する可能性があります。関節の角度は、手足間およびブタ間で標準化されなければならない。90°の足首関節角度は、股関節と膝に強く推奨されます。わずかに足底屈曲した足首の位置(中立の0°の足首関節角度から約30°)は、ピーク強度に最適です。これは、立っている間の豚と犬の両方の足首関節の自然な解剖学的位置を反映しています。また、すべてのジョイントはフットペダルおよびトルクトランスデューサと平行にして、垂直トルクベクトルの寄与による測定可能なトルクの損失を回避する必要があります。股関節 – 膝 – 足首関節の角度と足 – ペダル – 関節の位置合わせを検査することは、足をフットペダルに固定し、膝関節を四肢クランプバーで固定した後に強くお勧めします(図1)。ずれがある場合は、バーのロックを解除して取り外し、手術台に豚の位置を変えます。研究間で関節角度を標準化することは、データの分散を最小限に抑えるために重要ですが、以下で説明する注目すべき生体力学的アライメントには限界があります。
既存または代替方法に関する意義
ブタモデルに使用できる筋肉機能の臨床的関連性および非侵襲的評価の代替例には、トレッドミル歩行距離、EMG、および活動的な筋肉横波電気測定が含まれる。ヒトにおける6分間歩行試験として、トレッドミル歩行試験は、大型動物における疾患進行および介入成功を評価することができる33、34、35。典型的には、馴化期間の後、動物は、異なるトレッドミル速度および/または傾斜レベルでコンプライアンスの終わりまで歩行される。食物報酬は、多くの場合、最大のモチベーションを達成するために必要です。しかし、トレッドミル歩行転帰は、被験者の動機付け、非最大運動単位の募集、および心臓血管系、骨格系、呼吸器系などの他の身体系への固有の共依存などの制限のために、筋肉収縮機能の間接的な解釈のみを提供する。
一方、EMG電極は、関心のある筋肉群に直接配置されるので、筋電図系のわずかに良好な直接評価を提供する36、37、38。EMG電極は、集団的な筋活動(脱分極筋線維)を測定する。この筋活動は、運動単位の募集と速度符号化(募集された運動単位に送られる活動電位の頻度)に基づいている。しかし、モータユニットの募集とレートコーディングの相対的な寄与を分離することは、表面EMGでは不可能です。さらに、EMGは被験者が最大の収縮を生成する意欲に依存しており、このレベルの協力は大型動物モデルではありそうにない。歩行サイクル中の筋電図の変化を評価することは有益であり得るが、これらのデータは、関心のある骨格筋群の最大の機能的能力を表すものではない。Bモードおよび横波エラストグラフィーを利用した超音波ベースのイメージングは、筋肉機能を評価するために使用される別の非侵襲的モダリティである。エラストグラフィーによって測定されたヤング率と筋肉負荷の増加との間には良好な相関関係がある39,40。剪断波エラストグラフィーは、ブタ体積測定筋損失損傷モデル23において含む受動的組織剛性41、42、43、44、45の定量的尺度として検証および使用される。また、活動的な筋力産生39の間接的な測定として用いてもよい。しかし、被験者が収縮を行う意欲と協力に対するEMGに似た制限は依然として存在する。
ここに記載される in vivo プロトコルは、トレッドミル歩行距離およびEMGとは対照的に、筋肉機能の信頼性が高く、再現性があり、かつ最大評価を提供する。このプロトコルは、モチベーションとは無関係に、制御された定量化可能な方法で筋肉の収縮を呼び起こします。具体的には、経皮電極は、中枢神経系を迂回する軸索の神経を刺激するために使用される。神経軸索の脱分極は、すべての運動単位に関与し、運動単位の動員に関連する変動を排除する。さらに、研究者は、速度コーディング(刺激頻度)を制御する。このアプローチに適用される結果として生じる神経筋生理学は、ランヴィエの節における電位依存性ナトリウムチャネル活性化から始まる。その後のすべての(または下流の)生理学は、励起収縮結合およびクロスブリッジサイクリングを含む、関与する。 in vivo 非侵襲的筋肉分析の重要な利点は、収縮性筋機能を繰り返し、例えば毎週、傷害、介入、または疾患進行後の筋力を監視することができることである。
方法の制限事項
このプロトコルに記載された in vivo 機器は、関節角度および刺激周波数の関数として受動的および能動的アイソメトリックトルクを可能にする。使用される試験装置は、動的収縮(例えば、等動論的偏心または同心円収縮)の測定をサポートしていない。この装置は、トルク-ジョイント角度の関係を特徴付けるために105°の可動域を可能にし、最大トルク範囲が〜50N·mのロードセルを使用する。特定の実験的な質問には、これらの仕様外の性能特性が必要な場合があります。注目すべきことに、この記載された装置上のロードセルは、必要に応じてより大きなトルク範囲に交換され得る。
インビボで最大神経筋強度を測定するための本明細書に記載のプロトコールには、顕著な限界がある。第1に、この方法は麻酔を必要とし、これは動物施設のプロトコルおよび資源ごとに異なる方法で実施され得る。麻酔薬は神経筋機能に様々な効果を有することが知られており、麻酔薬型および用量依存的にマウスの生体内背筋トルク産生を変化させることが示されている29。大型動物の生体内トルクに対する麻酔薬の差異効果は不明である。したがって、対照群および実験群は、この変動性を制御するために同じ麻酔剤(例えば、ケタミンを投与されるすべての群)を有していなければならない。第二に、in vivo拡散パターンへの依存は、収縮機能障害および急性薬物毒性の細胞機構の探索を制限する。例えば、カフェインは、単離された筋肉のインビトロ器官浴試験中に、筋小胞体カルシウム放出を刺激し、興奮収縮結合46を直接バイパスするために使用することができる。この効果を誘導するカフェインの量(mM)は、in vivo設定では致命的である。このアプローチが急性筋力に対する薬物スクリーニングに使用される場合、全身に対する薬物の影響(例えば、腎臓/肝臓ストレス)および循環に分泌されるその後の要因を考慮する必要がある23。第三に、最大電気神経刺激の使用は、上で論じたように、自発的な募集戦略から逸脱しており、したがって、神経筋動員適応に起因する可能性のある強度の変化を反映していない。
インビボトルク測定は、実験観察のための特定のメカニズムを確立することに関しても制限され得る。例えば、足首関節に関するトルクは、筋力産生だけでなく、腱および関節および結合組織特性にも依存する。さらに、力は筋肉のグループ、特にブタの足底屈筋(腓腹筋、ヒラメ筋、足底筋)および背屈筋(腓骨三分節、脛骨筋、およびジジトルム筋)によって生成される。したがって、最大in vivoトルクデータの解釈は、潜在的な筋内膜および解剖学的変化を考慮する必要があり、個々の筋肉ではなく筋肉群に限定される。関連して、筋肉群は、足底屈筋の腓腹筋およびヒラメ筋などの主に速い筋線維および遅い筋線維の混合物からなることが多い。収縮および弛緩の速度(またはピークまでの時間収縮および半弛緩時間)などの収縮特性は、in vitroまたはin situ試験プロトコル47などの単離された筋肉調製物に対するin vivoを用いた繊維型生理学の信頼できる指標ではない。単離された筋肉製剤は、筋肉の長さなどの特性を正確に制御することができるため、筋肉機能に対する生体力学的パラメータの影響を理解するのにも優れている。腱(例えば、弛み)、筋肉(例えば、ペネーション角、筋節の重なり)、および関節(例えば、モーメントアーム)のトルク産生に寄与する特性は関節角度に依存するため、関節角度 – トルク関係は筋肉の長さ – 力関係と直接等価ではないことを強調することが重要である。そのために、大型動物のin situ機能試験48は、in situ試験が最終実験であることを念頭に置いて、in vivo試験への貴重な追加となり得る。実験的知見の機構的洞察を改善するために将来探求され得る現在のプロトコルへの他の進歩には、筋肉および腱の構造的特性を測定するための超音波Bモード画像化の使用、および随意および電気的に刺激された収縮中の筋力を測定するための腱力トランスデューサの移植49が含まれる。
この方法の重要性と潜在的な用途
このプロトコールは、ブタ背筋群の インビボ トルク産生能力を評価し、生理学的設定における筋機能の増減を評価する非侵襲的方法を実証する。この方法論はブタにとって非終末的であるため、疾患の進行中、または治療戦略の前、最中、および後に、同じ被験者の筋肉機能を縦方向に評価するためにも使用することができる。そのため、反復測定実験計画は、独立した測定と比較して、より大きな検出力とより少ない動物との堅牢な統計的比較を可能にする可能性がある。さらに、骨格筋機能障害は、慢性疾患関連筋消耗(例えば、心不全、腎不全、AIDS、癌など)、筋ジストロフィー、神経変性疾患(例えば、SMAまたは筋萎縮性側索硬化症;ALS)、老化(すなわち、サルコペニア)、および薬物毒性。骨格筋機能能力は、運動、栄養、薬物および再生医療療法などの介入のための重要な主要転帰尺度である。したがって、本明細書に記載のプロトコールは、 インビボでの ブタトルク生成能力を確実に評価するために、多数の研究用途にわたって使用され得る。これは、開発中の治療法の翻訳のための広範な動物データを取得するのに役立つかもしれません。
The authors have nothing to disclose.
提示された作業とデータは、BTCとSMG(#MR140099;#C_003_2015_USAISR;#C_001_2018_USAISR)への米国陸軍医学研究および材料司令部によって広く支援されました。退役軍人省、退役軍人保健局、研究開発局(I21 RX003188)は、JACとルーク・ブリュースター博士に。著者らは、USAISR獣医サービスおよび比較病理学部門とUMN先進前臨床イメージングセンターがこれらの研究を完了するための技術支援を高く評価している。
615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite | Aurora Scientific Inc. | 615A | Compatible Win Vista/7/10 |
892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 892A | Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners |
Calibration Weights | Ohaus or similar | 80850116 | |
Computer | Aurora Scientific or any vendor | 601A | Computer must include data acquisition card and interface for software |
Gauze pad | Various vendors | 4 by 4 squares or similar | |
Monopolar Needle Electrodes | Chalgren, Electrode Store, or similar vendor | 242-550-24TP, or DTM-2.00SAF | |
Non-adhesive Flexiable Tape | 3M, Coflex, or similar | 4 inch by 5 yard role | |
Stimulator | Aurora Scientific or comparable | 701C | Must include constant current stimulation mode |