Il presente protocollo descrive dettagli sperimentali concisi sulla valutazione e l’interpretazione dei dati di coppia in vivo ottenuti tramite stimolazione elettrica del nervo peroneale comune in suini anestetizzati.
Una valutazione affidabile della forza muscolare scheletrica è probabilmente la misura di esito più importante negli studi sulle malattie neuromuscolari e muscoloscheletriche e sulle lesioni, in particolare quando si valuta l’efficacia delle terapie rigenerative. Inoltre, un aspetto critico della traduzione di molte terapie rigenerative è la dimostrazione di scalabilità ed efficacia in un modello animale di grandi dimensioni. Vari preparati fisiologici sono stati stabiliti per valutare le proprietà intrinseche della funzione muscolare negli studi scientifici di base, principalmente in modelli di piccoli animali. Le pratiche possono essere classificate come: in vitro (fibre isolate, fasci di fibre o muscolo intero), in situ (muscolo con vascolarizzazione e innervazione intatte ma tendine distale attaccato a un trasduttore di forza) e in vivo (le strutture del muscolo o dell’unità muscolare rimangono intatte). Ci sono punti di forza e di debolezza in ciascuno di questi preparativi; tuttavia, un chiaro vantaggio dei test di resistenza in vivo è la capacità di eseguire misurazioni ripetute nello stesso animale. Qui vengono presentati i materiali e i metodi per valutare in modo affidabile la coppia isometrica prodotta dai muscoli dorsiflessori posteriori in vivo in risposta alla stimolazione elettrica peroneale standard nei suini anestetizzati.
La funzione primaria del muscolo scheletrico è quella di produrre forza, che alla fine rende possibili attività come respirare, mangiare e debulare. Le condizioni che riducono la capacità funzionale del muscolo scheletrico possono portare a una diminuzione delle prestazioni (professionali o sportive), disabilità o morte. Ad esempio, il mantenimento della massa muscolare e della funzione nelle popolazioni che invecchiano è positivamente associato alla qualità della vita e alla capacità di svolgere attività di base e strumentali della vita quotidiana 1,2. Inoltre, il declino della forza muscolare nei pazienti con distrofia muscolare di Duchenne provoca l’incapacità di deambulare e insufficienza respiratoria, contribuendo in ultima analisi alla mortalità prematura 3,4,5. Pertanto, la misurazione della forza muscolare è una misura di esito critico negli studi che coinvolgono malattie o lesioni neuromuscolari.
La coppia isometrica o isocinetica volontaria massima (e/o l’indice di fatica) è spesso usata come indice di capacità funzionale negli studi clinici6. Negli studi sugli animali, misurazioni analoghe possono essere effettuate in vivo utilizzando la stimolazione nervosa elettrica durante l’anestesia. In particolare, i preparati in vivo sono minimamente invasivi con muscolatura, tendini, vascolarizzazione e innervazione che rimangono intatti e quindi consentono ripetute valutazioni funzionali 7,8,9,10,11. Questa preparazione è comunemente usata nei modelli di piccoli roditori e in misura minore nei modelli animali più grandi come conigli12, cani13,14, pecore15 e maiali16,17. L’uso generale di tale metodologia potrebbe avere un impatto su molti studi di ricerca traslazionale, come nei modelli geneticamente modificati di atrofia muscolare spinale (SMA) suina (suino)18. Qui vengono presentati i metodi per valutare la coppia isometrica massima indotta dalla stimolazione nervosa del gruppo muscolare dorsiflessore suino in vivo. Le tecniche presentate sono state inizialmente adattate da quelle sviluppate originariamente per valutare la coppia del muscolo crurale anteriore del topo19,20 e successivamente perfezionate attraverso l’esperienza nello studio della capacità di produzione di coppia a seguito di lesioni 17,21,22,23,24,25,26,27,28 e durante lo sviluppo16 in vari modelli suini.
Questo protocollo evidenzia la misurazione isometrica della coppia in vivo utilizzando una metodologia che richiede un computer integrato con una cella di carico e uno stimolatore elettrico. I metodi qui presentati utilizzano un apparato di prova swine isometrico della pedana integrato disponibile in commercio, un apparato di piattaforma e il software corrispondente (vedere Tabella dei materiali). Tuttavia, la metodologia può essere adattata per utilizzare altri software disponibili in commercio o su misura, dispositivi di acquisizione dati e stimolatori. Questi metodi sono destinati all’uso in una suite chirurgica dedicata agli animali di grandi dimensioni piena di attrezzature standard come: tavolo chirurgico di bloccaggio, secondo tavolo di bloccaggio di uguale altezza per la piattaforma di prova, ventilatore e dispositivi di monitoraggio e tappetino riscaldante o altri dispositivi per mantenere la temperatura corporea.
I seguenti membri del team sono necessari per condurre questi metodi: un tecnico di anestesia qualificato e due personale di studio per eseguire i test funzionali. Queste persone lavoreranno insieme per la stabilizzazione iniziale dell’arto sull’apparato della piattaforma. Quindi, uno dei due membri del personale sarà responsabile del posizionamento / posizionamento dell’elettrodo e l’altro per le applicazioni informatiche durante il test.
Passaggi critici, modifiche e risoluzione dei problemi
Per ridurre al minimo la variabilità dei dati e massimizzare il successo dell’approccio, vengono evidenziati i seguenti passaggi critici.
Stimolazione nervosa ottimale
Questo approccio sperimentale inizia con la depolarizzazione degli assoni nervosi e si basa sul corretto posizionamento degli elettrodi e sulla stimolazione elettrica ottimizzata. Un’analisi post-mortem dell’anatomia nervosa correlata ai punti di riferimento ossei può aiutare a visualizzare il corretto posizionamento dell’elettrodo durante il test. L’acquisizione della coppia di contrazione massima aiuta a determinare la corrente appropriata (in milliampere; mA) erogata all’assone nervoso. Ci sono due valori da tenere a mente quando si ottimizza la stimolazione nervosa all’inizio del test: (1) il rapporto contrazione-tetanico è ~ 1: 5, ad esempio, ~ 2 N·m di coppia di contrazione corrisponde a una coppia tetanica di 10 N·m (Figura 3); e (2) la coppia tipica per la massa corporea è ~ 0,3 N·m per kg di massa corporea (Figura 4). Se le coppie di contrazione di picco appaiono basse, rimuovere gli elettrodi e tentare un altro posizionamento. Assicurarsi di controllare le impostazioni dello stimolatore, le connessioni BNC e le connessioni degli elettrodi. Il riposizionamento dell’elettrodo può essere necessario tra le contrazioni se c’è troppo movimento durante il posizionamento dell’arto tra gli angoli articolari, come notato sopra (Figura 2). Si prega di notare che gli approcci sperimentali e interventistici potrebbero avere un impatto su questi valori.
Corretto allineamento biomeccanico
La lunghezza muscolare iniziale influenza la forza contrattile muscolare (la relazione lunghezza-tensione) e la lunghezza muscolare può cambiare in base all’allineamento dell’articolazione dell’anca, del ginocchio e della caviglia. Gli angoli articolari devono essere standardizzati tra gli arti e tra i maiali. Un angolo di articolazione della caviglia di 90 ° è fortemente raccomandato per l’anca e il ginocchio. Una posizione della caviglia leggermente plantare (~ 30 ° dall’angolo neutro dell’articolazione della caviglia di 0 °) è ottimale per la forza di picco. Riflette la naturale posizione anatomica dell’articolazione della caviglia sia nei maiali che nei cani mentre si è in piedi. Tutti i giunti devono anche essere paralleli al pedale e ai torsiometri per evitare la perdita di coppia misurabile dovuta al contributo di un vettore di coppia perpendicolare. Si consiglia vivamente di ispezionare gli angoli dell’articolazione anca-ginocchio-caviglia e l’allineamento piede-pedale-articolazione dopo aver fissato il piede al pedale e aver fissato l’articolazione del ginocchio con le barre di bloccaggio degli arti (Figura 1). Se c’è un disallineamento, sbloccare e rimuovere le barre e riposizionare il maiale sul tavolo chirurgico. Mentre standardizzare gli angoli articolari tra gli studi è fondamentale per ridurre al minimo la varianza dei dati, ci sono limitazioni all’allineamento biomeccanico che sono notevoli, discusse di seguito.
Importanza rispetto ai metodi esistenti o alternativi
Esempi alterativi di valutazioni clinicamente rilevanti e non invasive della funzione muscolare che potrebbero essere utilizzate per i modelli suini includono la distanza a piedi del tapis roulant, l’EMG e l’elettrografia attiva dell’onda di taglio muscolare. Come il test di camminata di 6 minuti negli esseri umani, un test di camminata sul tapis roulant può valutare la progressione della malattia e il successo dell’intervento in animali di grandi dimensioni 33,34,35. Tipicamente, dopo un periodo di acclimatazione, gli animali vengono camminati fino alla fine della conformità a diverse velocità del tapis roulant e / o livelli di pendenza. Le ricompense alimentari sono spesso necessarie per raggiungere la massima motivazione. Tuttavia, i risultati della camminata sul tapis roulant offrono solo interpretazioni indirette della funzione contrattile muscolare a causa di limitazioni come la motivazione del soggetto, il reclutamento di unità motorie non massimali e la co-dipendenza intrinseca da altri sistemi corporei come i sistemi cardiovascolare, scheletrico e respiratorio.
D’altra parte, EMG offre una valutazione diretta leggermente migliore del sistema muscolare scheletrico, poiché gli elettrodi EMG sono posizionati direttamente sul gruppo muscolare di interesse 36,37,38. Gli elettrodi EMG misurano quindi l’attività muscolare collettiva (fibre muscolari depolarizzate). Questa attività muscolare si basa sul reclutamento dell’unità motoria e sulla codifica del tasso (la frequenza dei potenziali d’azione inviati alle unità motorie reclutate). Tuttavia, separare i contributi relativi del reclutamento dell’unità motoria rispetto alla codifica dei tassi è impossibile con l’EMG di superficie. Inoltre, l’EMG si basa sulla volontà del soggetto di generare contrazioni massime e questo livello di cooperazione è improbabile nei modelli di animali di grandi dimensioni. Mentre può essere informativo valutare i cambiamenti nell’EMG durante il ciclo dell’andatura, questi dati non rappresentano una capacità funzionale massima del gruppo muscolare scheletrico di interesse. L’imaging basato su ultrasuoni che utilizza la modalità B e l’elastografia ad onda di taglio è un’altra modalità non invasiva utilizzata per valutare la funzione muscolare. Esiste una buona correlazione tra il modulo di Young misurato mediante elastografia e l’aumento dei carichi muscolari39,40. L’elastografia ad onde di taglio è stata convalidata e utilizzata come misura quantitativa della rigidità passiva del tessuto 41,42,43,44,45, anche in un modello di danno da perdita muscolare volumetrica suina23. Può anche essere usato come misura indiretta della produzione di forza muscolare attiva39. Tuttavia, sono ancora presenti limitazioni simili all’EMG per la volontà del soggetto e la cooperazione di eseguire contrazioni.
Il protocollo in vivo qui descritto, in contrasto con la distanza a piedi del tapis roulant e l’EMG, fornisce una valutazione affidabile, riproducibile e massima della funzione muscolare. Questo protocollo evoca le contrazioni muscolari in modo controllato, quantificabile e indipendente dalla motivazione. In particolare, gli elettrodi percutanei vengono utilizzati per stimolare gli assoni nervosi bypassando il sistema nervoso centrale. La depolarizzazione degli assoni nervosi impegna tutte le unità motorie eliminando la variabilità associata al reclutamento delle unità motorie. Inoltre, lo sperimentatore controlla la codifica della velocità (frequenza di stimolazione). La fisiologia neuromuscolare risultante che si applica a questo approccio inizia con l’attivazione del canale del sodio voltaggio-dipendente ai nodi di Ranvier. Tutta la fisiologia successiva (o a valle) è impegnata, compreso l’accoppiamento eccitazione-contrazione e il ciclo cross-bridge. Un vantaggio significativo dell’analisi muscolare non invasiva in vivo è che la funzione muscolare contrattile può essere misurata ripetutamente, ad esempio settimanalmente, per monitorare la forza muscolare dopo un infortunio, un intervento o una progressione della malattia.
Limitazioni del metodo
L’apparecchiatura in vivo descritta in questo protocollo consente una coppia isometrica passiva e attiva in funzione dell’angolo articolare e della frequenza di stimolazione. L’apparato di prova utilizzato non supporta la misurazione delle contrazioni dinamiche (ad esempio, contrazioni eccentriche o concentriche isocinetiche). L’apparecchio consente un intervallo di movimento di 105° per caratterizzare il rapporto coppia-angolo di giunzione e utilizza una cella di carico con un intervallo di coppia massimo di ~50 N·m. Domande sperimentali specifiche possono richiedere caratteristiche prestazionali al di fuori di queste specifiche. In particolare, la cella di carico su questo apparecchio descritto può essere sostituita con intervalli di coppia più ampi, se necessario.
Il protocollo qui descritto per misurare la massima forza neuromuscolare in vivo presenta notevoli limitazioni. In primo luogo, questo metodo richiede l’anestesia, che può essere condotta in modo diverso per protocolli e risorse della struttura animale. Gli anestetici sono noti per avere effetti variabili sulla funzione neuromuscolare e hanno dimostrato di alterare la produzione di coppia dorsiflessore in vivo di topo in modo anestetico e dose-dipendente29. Gli effetti differenziali degli anestetici sulla coppia in vivo di grandi animali non sono chiari; pertanto, i gruppi di controllo e sperimentali devono avere gli stessi agenti di anestesia (ad esempio, tutti i gruppi a cui è stata somministrata ketamina) per controllare questa variabilità. In secondo luogo, la dipendenza da modelli di diffusione in vivo limita l’esplorazione dei meccanismi cellulari della disfunzione contrattile e della tossicità acuta dei farmaci. Ad esempio, la caffeina può essere utilizzata durante il test del bagno d’organo in vitro di un muscolo isolato per stimolare il rilascio di calcio del reticolo sarcoplasmatico, bypassando direttamente l’accoppiamento eccitazione-contrazione46 . La quantità di caffeina per indurre questo effetto (mM) è letale in un ambiente in vivo . Le influenze farmacologiche su tutto il corpo (ad esempio, lo stress renale / epatico) e i fattori successivi secreti in circolazione dovranno essere considerati se questo approccio viene utilizzato per lo screening farmacologico sulla forza muscolare acuta23. In terzo luogo, l’uso della massima stimolazione nervosa elettrica si discosta dalle strategie di reclutamento volontario, come discusso sopra, e quindi non riflette i cambiamenti di forza che possono essere dovuti ad adattamenti di reclutamento neuromuscolare.
Le misurazioni della coppia in vivo possono anche essere limitate per quanto riguarda la definizione di un meccanismo specifico per le osservazioni sperimentali. Ad esempio, la coppia intorno all’articolazione della caviglia dipende non solo dalla produzione di forza muscolare, ma anche dal tendine e dalle proprietà articolari e del tessuto connettivo. Inoltre, la forza è generata da gruppi di muscoli, in particolare i flessori plantari (muscoli gastrocnemio, soleo e plantare) e i dorsiflessori (muscoli peroneus tertius, tibialis e digitorum) nei suini. Pertanto, le interpretazioni dei dati massimi di coppia in vivo richiedono la considerazione di potenziali cambiamenti muscolotendinei e anatomici e sono limitate ai gruppi muscolari, non ai singoli muscoli. In relazione a ciò, i gruppi muscolari sono spesso costituiti da una miscela di fibre muscolari prevalentemente veloci e lente, come il muscolo gastrocnemio e il muscolo soleo, rispettivamente, dei flessori plantari. Le proprietà contrattili come il tasso di contrazione e rilassamento (o la contrazione time-to-peak e il tempo di semi-rilassamento) non sono indicatori affidabili della fisiologia del tipo di fibra utilizzando preparazioni muscolari in vivo rispetto a quelle isolate, come i protocolli di test in vitro o in situ 47. I preparati muscolari isolati sono anche superiori nella comprensione dell’influenza dei parametri biomeccanici sulla funzione muscolare perché proprietà come la lunghezza muscolare possono essere controllate con precisione; è importante sottolineare che la relazione angolo-coppia articolare non è direttamente equivalente alla relazione lunghezza-forza muscolare, poiché le proprietà tendinee (ad esempio, rilassamento), muscolo (ad esempio, angolo di pennazione, sovrapposizione sarcomero) e articolazione (ad esempio, braccio momento) che contribuiscono alla produzione di coppia dipendono dall’angolo articolare. A tal fine, i test funzionali in situ per animali di grandi dimensioni48 potrebbero costituire una preziosa aggiunta ai test in vivo, tenendo presente che i test in situ sono un esperimento terminale. Altri progressi al protocollo attuale che potrebbero essere esplorati in futuro per migliorare l’intuizione meccanicistica dei risultati sperimentali includono l’uso dell’imaging a ultrasuoni in modalità B per misurare le proprietà architettoniche muscolari e tendinee e l’impianto di un trasduttore di forza tendinea per misurare la forza muscolare durante le contrazioni volontarie ed elettricamente stimolate49.
Importanza e potenziali applicazioni del metodo
Questo protocollo valuta in vivo la capacità di produzione di coppia del gruppo muscolare dorsiflessore suino, dimostrando un metodo non invasivo per valutare il guadagno o la perdita della funzione muscolare in un contesto fisiologico. Poiché la metodologia non è terminale per il maiale, può anche essere utilizzata per valutare la funzione muscolare negli stessi soggetti longitudinalmente durante la progressione di una malattia, o prima, durante e dopo una strategia di trattamento. Pertanto, una progettazione sperimentale di misure ripetute può consentire solidi confronti statistici con maggiore potenza e meno animali rispetto a misure indipendenti. Inoltre, la disfunzione del muscolo scheletrico è una componente saliente di vari processi e condizioni patologiche, come lo spreco muscolare cronico associato a malattie (ad esempio, insufficienza cardiaca, insufficienza renale, AIDS, cancro, ecc.), Distrofia muscolare, malattie neurodegenerative (ad esempio, SMA o sclerosi laterale amiotrofica; SLA), invecchiamento (cioè sarcopenia) e tossicità dei farmaci. La capacità funzionale del muscolo scheletrico è una misura di esito primario critico per interventi come l’esercizio fisico, la nutrizione e le terapie farmacologiche e di medicina rigenerativa. Pertanto, il protocollo qui descritto per valutare in modo affidabile la capacità di produzione di coppia suina in vivo può essere utilizzato in numerose applicazioni di studio. Può essere strumentale nell’acquisizione di ampi dati sugli animali per la traduzione di terapie in via di sviluppo.
The authors have nothing to disclose.
Il lavoro e i dati presentati sono stati ampiamente supportati dall’US Army Medical Research and Material Command a BTC e SMG (#MR140099; #C_003_2015_USAISR; #C_001_2018_USAISR); e il Dipartimento degli affari dei veterani, l’Amministrazione sanitaria dei veterani, l’Ufficio di ricerca e sviluppo (I21 RX003188) a JAC e al Dr. Luke Brewster. Gli autori riconoscono con gratitudine il servizio veterinario USAISR e i rami di patologia comparativa e il centro di imaging preclinico avanzato UMN per l’assistenza tecnica nel completamento di questi studi.
615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite | Aurora Scientific Inc. | 615A | Compatible Win Vista/7/10 |
892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 892A | Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners |
Calibration Weights | Ohaus or similar | 80850116 | |
Computer | Aurora Scientific or any vendor | 601A | Computer must include data acquisition card and interface for software |
Gauze pad | Various vendors | 4 by 4 squares or similar | |
Monopolar Needle Electrodes | Chalgren, Electrode Store, or similar vendor | 242-550-24TP, or DTM-2.00SAF | |
Non-adhesive Flexiable Tape | 3M, Coflex, or similar | 4 inch by 5 yard role | |
Stimulator | Aurora Scientific or comparable | 701C | Must include constant current stimulation mode |