Den foreliggende protokol beskriver kortfattede eksperimentelle detaljer om evaluering og fortolkning af in vivo-momentdata opnået ved elektrisk stimulering af den fælles peroneale nerve hos bedøvede svin.
Pålidelig vurdering af skeletmuskulaturens styrke er uden tvivl det vigtigste resultatmål i neuromuskulære og muskuloskeletale sygdoms- og skadesundersøgelser, især når man evaluerer regenerative terapiers effektivitet. Derudover er et kritisk aspekt ved oversættelse af mange regenerative terapier demonstrationen af skalerbarhed og effektivitet i en stor dyremodel. Forskellige fysiologiske præparater er blevet etableret for at evaluere iboende muskelfunktionsegenskaber i grundvidenskabelige studier, primært i små dyremodeller. Praksis kan kategoriseres som: in vitro (isolerede fibre, fiberbundter eller hele muskler), in situ (muskel med intakt vaskularisering og innervering, men distal sene fastgjort til en krafttransducer) og in vivo (strukturer i muskel eller muskelenhed forbliver intakte). Der er styrker og svagheder ved hvert af disse præparater; En klar fordel ved in vivo-styrketest er imidlertid evnen til at udføre gentagne målinger i det samme dyr. Heri præsenteres materialer og metoder til pålideligt at vurdere isometrisk drejningsmoment produceret af bagbenet dorsiflexor muskler in vivo som reaktion på standard peroneal elektrisk stimulering hos anæstesisvin.
Skeletmuskulaturens primære funktion er at producere kraft, hvilket i sidste ende gør aktiviteter som vejrtrækning, spisning og ambulering mulig. Tilstande, der reducerer skeletmuskulaturens funktionsevne, kan føre til nedsat ydeevne (erhvervsmæssig eller sport), handicap eller død. For eksempel er opretholdelsen af muskelmasse og funktion i aldrende befolkninger positivt forbundet med livskvalitet og evnen til at udføre grundlæggende og instrumentelle aktiviteter i dagligdagen 1,2. Og faldende muskelstyrke hos Duchenne muskeldystrofipatienter resulterer i manglende evne til at ambulere og respirationssvigt, hvilket i sidste ende bidrager til for tidlig dødelighed 3,4,5. Således er muskelstyrkemåling et kritisk resultatmål i undersøgelser, der involverer neuromuskulær sygdom eller skade.
Maksimalt frivilligt isometrisk eller isokinetisk drejningsmoment (og/eller udmattelsesindeks) anvendes ofte som et indeks for funktionsevne i kliniske undersøgelser6. I dyreforsøg kan analoge målinger foretages in vivo ved hjælp af elektrisk nervestimulering under anæstesi. Især in vivo-præparater er minimalt invasive, idet muskulatur, sener, vaskulatur og innervation forbliver intakte og tillader derfor gentagne funktionelle vurderinger 7,8,9,10,11. Dette præparat anvendes almindeligvis i små gnavermodeller og i mindre grad i større dyremodeller som kaniner12, hunde13,14, får15 og svin16,17. Den generelle anvendelse af en sådan metode kan have indvirkning på mange translationelle forskningsundersøgelser, f.eks. i genetisk manipulerede svinemodeller (svin) af spinal muskelatrofi (SMA)18. Heri præsenteres metoder til vurdering af nervestimuleringsinduceret maksimalt isometrisk drejningsmoment for svinens dorsiflexor muskelgruppe in vivo. De præsenterede teknikker blev oprindeligt tilpasset fra dem, der oprindeligt blev udviklet til at vurdere musens forreste crural muskelmoment 19,20 og efterfølgende raffineret gennem erfaring med at undersøge momentproducerende kapacitet efter skade 17,21,22,23,24,25,26,27,28 og under udvikling16 i forskellige svinemodeller.
Denne protokol fremhæver in vivo isometrisk momentmåling ved hjælp af metoder, der kræver en computer integreret med en vejecelle og elektrisk stimulator. De metoder, der præsenteres her, bruger et kommercielt tilgængeligt integreret svineisometrisk fodpladetestapparat, platformsapparat og tilsvarende software (se materialetabel). Metoden kan dog tilpasses til at bruge anden kommercielt tilgængelig eller skræddersyet software, dataindsamlingsenheder og stimulatorer. Disse metoder er beregnet til brug i en dedikeret kirurgisk pakke med store dyr fyldt med standardudstyr såsom: låsekirurgisk bord, andet låsebord af samme højde til testplatformen, ventilator- og overvågningsenheder og varmemåtte eller andre enheder til opretholdelse af kropstemperaturen.
Følgende teammedlemmer er nødvendige for at udføre disse metoder: en dygtig anæstesitekniker og to undersøgelsespersonale til at udføre den funktionelle test. Disse mennesker vil arbejde sammen for den indledende stabilisering af lemmet på platformsapparatet. Derefter vil det ene af de to medarbejdere være ansvarligt for elektrodeplaceringen /positionen og det andet for computerapplikationerne under testen.
Kritiske trin, ændringer og fejlfinding
For at minimere datavariabilitet og maksimere tilgangens succes fremhæves følgende kritiske trin.
Optimal nervestimulering
Denne eksperimentelle tilgang starter med nerveaxondepolarisering og er afhængig af korrekt elektrodeplacering og optimeret elektrisk stimulering. En post mortem analyse af nerveanatomi relateret til boney landemærker kan hjælpe med at visualisere korrekt elektrode placering under test. Erhvervelse af maksimalt trækmoment hjælper med at bestemme passende strøm (i milliampere; mA), der leveres til nerveaxonen. Der er to værdier, man skal huske på, når man optimerer nervestimulering ved testens begyndelse: (1) træk-til-tetan-forholdet er ~1:5, f.eks. ~2 N·m trækmoment svarer til et 10 N·m tetanisk drejningsmoment (figur 3); og (2) det typiske drejningsmoment i henhold til kropsmasse er ~0,3 N·m pr. kg legemsmasse (figur 4). Hvis de maksimale trækmomenter ser lave ud, skal du fjerne elektroderne og forsøge en anden placering. Sørg for at kontrollere stimulatorindstillinger, BNC-forbindelser og elektrodeforbindelser. Elektrodeplacering kan være nødvendig mellem sammentrækninger, hvis der er for meget bevægelse under placeringen af lemmet mellem ledvinkler, som nævnt ovenfor (figur 2). Bemærk, at eksperimentelle og interventionelle tilgange kan påvirke disse værdier.
Korrekt biomekanisk justering
Startmuskellængde påvirker muskelkontraktil kraft (længdespændingsforholdet), og muskellængden kan ændre sig baseret på hofte-, knæ- og ankelledjustering. Ledvinklerne skal standardiseres mellem lemmer og blandt svin. En 90° ankelledsvinkel anbefales kraftigt til hofte og knæ. En let plantarflexet ankelposition (~ 30 ° fra den neutrale 0 ° ankelledvinkel) er optimal til maksimal styrke. Det afspejler den naturlige anatomiske position af ankelleddet hos både svin og hunde, mens de står. Alle samlinger skal også være parallelle med fodpedalen og momenttransducerne for at undgå tab af målbart drejningsmoment på grund af bidraget fra en vinkelret momentvektor. Inspektion af hofte-knæ-ankel-ledvinklerne og fod-pedal-led-justering anbefales kraftigt efter fastgørelse af foden til fodpedalen og fastgørelse af knæleddet med lemmens fastspændingsstænger (figur 1). Hvis der er forkert justering, skal du låse stængerne op og fjerne dem og flytte grisen på operationsbordet. Mens standardisering af fælles vinkler på tværs af undersøgelser er afgørende for at minimere datavarians, er der begrænsninger for biomekanisk justering, der er bemærkelsesværdige, diskuteret nedenfor.
Betydning med hensyn til eksisterende eller alternative metoder
Alterative eksempler på klinisk relevante og ikke-invasive vurderinger af muskelfunktion, der kan bruges til svinemodeller, omfatter løbebånds gåafstand, EMG og aktiv muskelforskydningsbølgeelektrografi. Som 6 minutters gangtest hos mennesker kan en løbebåndstest evaluere sygdomsprogression og interventionssucces hos store dyr 33,34,35. Efter en akklimatiseringsperiode går dyrene typisk indtil slutningen af overholdelsen ved forskellige løbebåndshastigheder og / eller hældningsniveauer. Madbelønninger er ofte nødvendige for at opnå maksimal motivation. Løbebåndsvandringsresultater tilbyder imidlertid kun indirekte fortolkninger af muskelkontraktil funktion på grund af begrænsninger som emnemotivation, ikke-maksimal rekruttering af motoriske enheder og iboende medafhængighed af andre kropssystemer såsom kardiovaskulære, skelet- og åndedrætssystemer.
På den anden side tilbyder EMG en lidt bedre direkte vurdering af skeletmuskelsystemet, da EMG-elektroder placeres direkte på muskelgruppen af interesse 36,37,38. EMG-elektroder måler derefter den kollektive muskelaktivitet (depolariserede muskelfibre). Denne muskelaktivitet er baseret på rekruttering af motoriske enheder og hastighedskodning (hyppigheden af aktionspotentialer sendt til rekrutterede motoriske enheder). Det er imidlertid umuligt at adskille de relative bidrag fra rekruttering af motorenheder i forhold til hastighedskodning med overflade-EMG. Endvidere er EMG afhængig af subjektets vilje til at generere maksimale sammentrækninger, og dette niveau af samarbejde er usandsynligt i stordyrsmodeller. Selvom det kan være informativt at vurdere ændringer i EMG under gangcyklussen, repræsenterer disse data ikke en maksimal funktionel evne hos skeletmuskelgruppen af interesse. Ultralydbaseret billeddannelse ved hjælp af B-tilstand og forskydningsbølgeelastografi er en anden ikke-invasiv modalitet, der bruges til at evaluere muskelfunktionen. Der er en god sammenhæng mellem Youngs modul målt ved elastografi og stigende muskelbelastning39,40. Shear-wave elastografi er blevet valideret og anvendt som et kvantitativt mål for passiv vævsstivhed 41,42,43,44,45, herunder i en svinevolumen muskeltabsskademodel23. Det kan også anvendes som en indirekte måling af aktiv muskelkraftproduktion39. Begrænsninger, der ligner EMG for fagvillighed og samarbejde om at udføre sammentrækninger, er dog stadig til stede.
In vivo-protokollen , der er beskrevet her, i modsætning til løbebånds gåafstand og EMG, giver en pålidelig, reproducerbar og maksimal vurdering af muskelfunktionen. Denne protokol fremkalder muskelkontraktioner på en kontrolleret, kvantificerbar måde, der er uafhængig af motivation. Specifikt bruges perkutane elektroder til at stimulere nerver axoner omgå centralnervesystemet. Depolarisering af nerveaxonerne engagerer alle motoriske enheder, hvilket eliminerer variabilitet forbundet med rekruttering af motoriske enheder. Derudover kontrollerer investigator hastighedskodning (stimuleringsfrekvens). Den resulterende neuromuskulære fysiologi, der gælder for denne tilgang, starter med spændingsgated natriumkanalaktivering ved Ranviers knuder. Al efterfølgende (eller nedstrøms) fysiologi er involveret, herunder excitation-sammentrækningskobling og cross-bridge cykling. En væsentlig fordel ved in vivo ikke-invasiv muskelanalyse er, at kontraktil muskelfunktion kan måles gentagne gange, for eksempel ugentligt, for at overvåge muskelstyrken efter skade, intervention eller over en sygdomsprogression.
Begrænsninger af metoden
Det in vivo-udstyr , der er beskrevet i denne protokol, tillader passivt og aktivt isometrisk drejningsmoment som funktion af ledvinkel og stimuleringsfrekvens. Det anvendte prøvningsapparat understøtter ikke måling af dynamiske sammentrækninger (f.eks. isokinetiske excentriske eller koncentriske sammentrækninger). Apparatet tillader et bevægelsesområde på 105° at karakterisere forholdet mellem drejningsmoment og ledvinkel og bruger en vejecelle med et maksimalt drejningsmomentområde på ~50 N·m. Specifikke eksperimentelle spørgsmål kan kræve ydeevneegenskaber uden for disse specifikationer. Navnlig kan vejecellen på dette beskrevne apparat udskiftes med større momentområder, hvis det er nødvendigt.
Protokollen beskrevet heri for at måle maksimal neuromuskulær styrke in vivo har bemærkelsesværdige begrænsninger. For det første kræver denne metode anæstesi, som kan udføres forskelligt pr. Dyrefacilitetsprotokoller og ressourcer. Bedøvelsesmidler er kendt for at have varierende virkninger på neuromuskulær funktion og har vist sig at ændre mus in vivo dorsiflexor drejningsmomentproduktion på en bedøvelsestype og -dosisafhængig måde29. De differentielle virkninger af anæstetika på det store dyr in vivo drejningsmoment er uklare; Derfor skal kontrol- og eksperimentelle grupper have de samme anæstesimidler (f.eks. Alle grupper administreret ketamin) for at kontrollere denne variabilitet. For det andet begrænser afhængighed af in vivo-diffusionsmønstre udforskningen af cellulære mekanismer for kontraktil dysfunktion og akutte lægemiddeltoksiciteter. For eksempel kan koffein anvendes under in vitro-organbadstest af en isoleret muskel for at stimulere sarkoplasmatisk retikulumcalciumfrigivelse, omgå excitation-kontraktionskobling46 direkte. Mængden af koffein til at fremkalde denne effekt (mM) er dødelig i en in vivo-indstilling . Lægemiddelpåvirkninger på hele kroppen (f.eks. nyre-/leverstress) og efterfølgende faktorer, der udskilles i omløb, skal overvejes, hvis denne fremgangsmåde anvendes til lægemiddelscreening på akut muskelstyrke23. For det tredje afviger brugen af maksimal elektrisk nervestimulering fra frivillige rekrutteringsstrategier, som diskuteret ovenfor, og afspejler derfor ikke ændringer i styrke, der kan skyldes neuromuskulære rekrutteringstilpasninger.
In vivo-momentmålinger kan også begrænses med hensyn til etablering af en specifik mekanisme til eksperimentelle observationer. For eksempel afhænger drejningsmomentet omkring ankelleddet ikke kun af muskelkraftproduktion, men også af senen og leddet og bindevævets egenskaber. Desuden genereres kraft af grupper af muskler, specifikt plantar flexors (gastrocnemius, soleus og plantaris muskler) og dorsiflexors (peroneus tertius, tibialis og digitorum muskler) hos svin. Derfor kræver fortolkninger af maksimale in vivo-momentdata overvejelse af potentielle muskulotendinøse og anatomiske ændringer og er begrænset til muskelgrupper, ikke individuelle muskler. Relateret består muskelgrupper ofte af en blanding af overvejende hurtige og langsomme muskelfibre, såsom henholdsvis gastrocnemius og soleus muskel af plantar flexors. Kontraktile egenskaber såsom sammentrækningshastighed og afslapning (eller tid-til-spids sammentrækning og halv afslapningstid) er ikke pålidelige indikatorer for fibertypefysiologi ved hjælp af in vivo versus isolerede muskelpræparater, såsom in vitro– eller in situ-testprotokoller 47. Isolerede muskelpræparater er også overlegne i forståelsen af biomekaniske parametres indflydelse på muskelfunktionen, fordi egenskaber som muskellængde kan kontrolleres præcist; det er vigtigt at understrege, at forholdet mellem ledvinkel og drejningsmoment ikke svarer direkte til forholdet mellem muskellængde og kraft, da sener (f.eks. Slap), muskler (f.eks. Pennationsvinkel, sarkomeroverlapning) og ledegenskaber (f.eks. Momentarm), der bidrager til momentproduktion, er afhængige af ledvinklen. Med henblik herpå kan funktionel testning af store dyr in situ 48 være et værdifuldt supplement til in vivo-testning, idet der tages hensyn til, at in situ-test er et terminalt forsøg. Andre fremskridt til den nuværende protokol, der kan udforskes i fremtiden for at forbedre den mekanistiske indsigt i eksperimentelle fund, omfatter anvendelse af ultralyd B-mode billeddannelse til måling af muskel- og senearkitektoniske egenskaber og implantation af en senekrafttransducer til måling af muskelkraft under frivillige og elektrisk stimulerede sammentrækninger49.
Betydningen og potentielle anvendelser af metoden
Denne protokol evaluerer in vivo momentproducerende kapacitet i svine dorsiflexor muskelgruppen, hvilket demonstrerer en ikke-invasiv metode til at vurdere gevinst eller tab af muskelfunktion i en fysiologisk indstilling. Fordi metoden er ikke-terminal for grisen, kan den også bruges til at evaluere muskelfunktionen hos de samme forsøgspersoner i længderetningen under udviklingen af en sygdom eller før, under og efter en behandlingsstrategi. Som sådan kan et forsøgsdesign med gentagne foranstaltninger give mulighed for solide statistiske sammenligninger med større kraft og færre dyr sammenlignet med uafhængige foranstaltninger. Derudover er skeletmuskeldysfunktion en fremtrædende komponent i forskellige sygdomsprocesser og tilstande, såsom kronisk sygdomsrelateret muskelsvind (f.eks. Hjertesvigt, nyresvigt, AIDS, kræft osv.), Muskeldystrofi, neurodegenerative sygdomme (f.eks. SMA eller amyotrofisk lateral sklerose; ALS), aldring (dvs. sarkopeni) og lægemiddeltoksiciteter. Skeletmuskulaturens funktionelle kapacitet er et kritisk primært resultatmål for interventioner som motion, ernæring og lægemiddel- og regenerative medicinterapier. Den protokol, der er beskrevet heri for pålideligt at evaluere svinemomentets produktionskapacitet in vivo, kan således anvendes på tværs af adskillige undersøgelsesapplikationer. Det kan være medvirkende til at erhverve omfattende dyredata til oversættelse af udviklende terapier.
The authors have nothing to disclose.
Arbejde og data, der blev præsenteret, blev bredt støttet af US Army Medical Research and Material Command til BTC og SMG (#MR140099; #C_003_2015_USAISR; #C_001_2018_USAISR); og Department of Veterans Affairs, Veterans Health Administration, Office of Research and Development (I21 RX003188) til JAC og Dr. Luke Brewster. Forfatterne anerkender taknemmeligt USAISR Veterinary Service and Comparative Pathology Branches og UMN Advanced Preclinical Imaging Center for teknisk bistand til at gennemføre disse undersøgelser.
615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite | Aurora Scientific Inc. | 615A | Compatible Win Vista/7/10 |
892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 892A | Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners |
Calibration Weights | Ohaus or similar | 80850116 | |
Computer | Aurora Scientific or any vendor | 601A | Computer must include data acquisition card and interface for software |
Gauze pad | Various vendors | 4 by 4 squares or similar | |
Monopolar Needle Electrodes | Chalgren, Electrode Store, or similar vendor | 242-550-24TP, or DTM-2.00SAF | |
Non-adhesive Flexiable Tape | 3M, Coflex, or similar | 4 inch by 5 yard role | |
Stimulator | Aurora Scientific or comparable | 701C | Must include constant current stimulation mode |