Her presenterer vi en protokoll for å oppnå mikroberegnet tomografibilder med høy oppløsning av sunne og patologiske store pattedyr hele hjerter med kollagen-selektiv kontrastforbedring.
Strukturell ombygging er en vanlig konsekvens av kroniske patologiske påkjenninger pålagt hjertet. Å forstå de arkitektoniske og komposisjonelle egenskapene til sykt vev er avgjørende for å bestemme deres interaksjoner med arytmisk oppførsel. Mikroskala vevsoppussing, under den kliniske oppløsningen, fremstår som en viktig kilde til dødelig arytmi, med høy utbredelse hos unge voksne. Det gjenstår fortsatt utfordringer med å oppnå høy bildekontrast med tilstrekkelig mikroskalaoppløsning for prekliniske modeller, for eksempel store pattedyrhjerter. Videre mangler vevssammensetning-selektiv kontrastforbedring for tredimensjonal høyoppløselig avbildning fortsatt. Ikke-destruktiv avbildning ved hjelp av mikro-beregnet tomografi viser løfte om høyoppløselig avbildning. Målet var å lindre lidelser ved røntgen over demping i store biologiske prøver. Hjerter ble ekstrahert fra friske griser (N = 2), og sauer (N = 2) med enten indusert kronisk hjerteinfarkt og fibrotisk arrdannelse eller indusert kronisk atrieflimmer. Eksisjonerte hjerter ble perfundert med: en saltløsning supplert med et kalsiumion slukkemiddel og en vasodilator, etanol i seriell dehydrering og heksametyldisilizan under vakuum. Sistnevnte forsterket hjertestrukturen under lufttørking i 1 uke. Kollagen-dominerende vev var selektivt bundet av et røntgenkontrastforbedrende middel, fosfomolybdic syre. Vevskonformasjonen var stabil i luften, noe som tillot langvarige mikrocomputerte tomografianskaffelser for å oppnå høyoppløselige (isotrope 20,7 μm) bilder. Optimal kontrastmiddelbelastning ved diffusjon viste selektiv kontrastforbedring av epitellaget og sub-endokardielle Purkinje-fibre i sunne gris ventrikler. Atrieflimmerhjerter (AF) viste forbedret kontrastakkumulering i de bakre veggene og vedleggene til atriene, tilskrevet større kollageninnhold. Myokardinfarkthjerter viste økt kontrast selektivt i områder av hjertefibrose, noe som gjorde det mulig å identifisere vevende overlevende myokardmuskulaturfibre. Kontrastforbedrede lufttørkede vevspreparater gjorde det mulig å farge mikroskala avbildning av det intakte store pattedyrhjertet og selektiv kontrastforbedring av underliggende sykdomsbestanddeler.
Strukturell hjertesykdom står for det meste av hjerterelatert dødelighet over hele verden1. Ombygging av hjertestruktur påvirker myokardmiljøet og interstitialrommet. Siden både hjerteelektrisk og mekanisk funksjon avhenger av myocyttorganisasjon, kan forstyrrelser føre til utålelig hjertearytmi, nedsatt blodpumpende handlinger og hjertesvikt 2,3,4,5,6,7,8,9. Utviklingen av kurative terapier for strukturelle hjertesykdommer oppveies langt av sykdomsprevalensen 2,5. Som sådan dukker det opp økende antall prekliniske modeller av strukturelle hjertesykdommer for å bedre forstå de anatomo-morfologiske profilene og resulterende patogenese av hjertearytmier 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23. Observert på tvers av strukturelt sykdomsspekter er oppregulering av interstitiell fibrose og, mer vanlig i iskemirelaterte tilfeller, myokard erstatning ved fibrose og fettvev18. Morfologisk forståelse av patologiske ekstracellulære komponenter kan muliggjøre identifisering av potensielle substrater av arytmi. Fordelingen og omfanget av sykdommen gir sterke indikatorer på arytmogene risikoer. Likevel gjenstår utfordringer med omfattende bildesykdomsprofiler ved å integrere makro- og mikroskalaer i det intakte hjertet.
Mikro-beregnet tomografi (microCT), basert på røntgenstråler, fremstår som et kraftig verktøy for å forhøre bløt biologisk vev mikrostruktur ved hjelp av kontrastmidler. Svært detaljerte anatomiske kart er oppnådd for hjerter fra små gnagere 24,25,26 og små dissekerte prøver fra store pattedyrhjerter 27,28. Imidlertid presenterer avbildning på hele organnivået av store pattedyrhjerter overdreven banelengder over hvilke røntgenfotoner dempes ved hjelp av konvensjonelle vevsforberedelsesteknikker. Dette innebærer kontrastlasting av vevet og nedsenking av prøven i et kontrastmiddelløsningsmiddel under oppkjøpet. Hvis du øker utvalgsstørrelsen og oppløsningen, forlenges den totale anskaffelsestiden. Derfor blir vevsstabilitet avgjørende for brukbar bilderekonstruksjon, noe som betyr at vevsdeformasjon som følge av tørking må forhindres. Bruken av en nedsenkningsvæske har imidlertid ulemper: (i) den generelle bakgrunnssignalintensiteten blir ikke ubetydelig og (ii) fremmer fortynning av vevsbundne kontrastmolekyler. Begge disse faktorene bidrar til å redusere bildekontrasten.
Denne studien beskriver en ny vevsbehandlingsrørledning for å lindre fotondemping i bakgrunnen og optimalisere det dynamiske området som tilbys av kontrastforbedringsagenter. Det foreslås å bruke en vevslufttørking tilnærming med kjemisk vevsforsterkning for å begrense vevsdeformasjon29. Derfor kan vevsprøver forbli stabile i luften for lange oppkjøp og utelate bakgrunnsbidrag fra nedsenkningsvæsker. Denne metodikkrørledningen gir: (i) en omfattende vevsbehandlings- og bildeprotokoll optimalisert ved hjelp av hele grishjerter; (ii) en evaluering av kontrastkonsentrasjon og lasteteknikker og( iii) anvendelse av denne rørledningen i to distinkte kroniske sykdomsmodeller av atrieflimmer og hjerteinfarkt i sauehjerter. Utvikling av kroniske sykdomsmodeller har blitt beskrevet andre steder for hver kroniske hjertesykdomsmodell, hjerteinfarkt indusert av perkutan koronararterieemboli13 og selvforsynt atrieflimmer30.
En detaljert protokoll for store vevspreparater er satt ut ved hjelp av hele hjerter fra store pattedyr for etterfølgende høyoppløselig strukturell avbildning. En lufttørkende tilnærming fjernet påvirkninger av røntgendemping i bakgrunnen og maksimalt optimalisering av vev: bakgrunnskontrast29. Ved hjelp av denne tilnærmingen ble det oppnådd en isotropisk oppløsning i området 20 μm for volumetrisk avbildning på tvers av prøver opp til 7,2 cm i diameter. MikroCT av bløtvev er imidlertid vanligvis avhengig av bruk av ikke-spesifikke kontrastmidler for å forbedre røntgenabsorpsjon og følsomhet for mikro-CT-systemer34. Selv om røntgenkontrastmidler forbedrer den generelle røntgendempingen og avbildningsforbedringen av bløtvev, er separasjon av vevsbestanddeler basert på biokjemisk sammensetning fortsatt utfordrende. Det ble imidlertid observert at bruk av lufttørkede hjerter i kombinasjon med et vanlig røntgenkontrastmiddel i laboratorieinnstillingen, PMA, selektivt farget ekstracellulære komponenter. Bindevev forbundet med sunt myokardium og patologisk strukturell ombygging ved kroniske sykdommer ble forbedret.
Prosessen med lufttørkende biologisk vev krever en intervensjon for å motstå deformasjonen av prøven. Prøvepreparering for elektronmikroskopi har lignende krav. Vanligvis brukes en kritisk tørkemetode, som bruker en balanse mellom vevsinnlevelsesmedium, temperatur og trykk for å eliminere overflatespenning av vevets flytende innhold, noe som forårsaker deformasjon på molekylært nivå ved fordampning35. Denne tilnærmingen krever jevn utskifting av prøvens vanninnhold med flytende karbondioksid, noe som er mer pålitelig i små og lett diffusible prøver. Alternativt kan vevets strukturelle integritet forbedres og lufttørking, det vil si at fordampningsfasen kan påføres over en lengre periode for å redusere den totale deformasjonen. Molekylet HMDS gjennomgår silylering for å danne et silikonbasert stillas for å forsterke og stabilisere den molekylære organiseringen av vevsprøven36. Fordampning forlenges ytterligere ved å begrense sirkulerende luftstrømmer fra miljøet, også for å unngå inhomogen fordampning, spesielt mellom prøveoverflaten og intramurale lag.
Tallrike kontrastmidler har tidligere blitt brukt til mikro-TIL-avbildning av bløtvev. De vanligste er jod, fosfotungstisk syre (PTA) og PMA. Jod har særlig vært ansatt på grunn av en høyere diffusjonsratepå 34,37,38. Likevel fungerer jod som en katalysator for silylering av HMDS reagens36. Den katalyserte reaksjonen er aggressiv og eksotermisk, med høy risiko for ødeleggelse av prøven og sikkerhetsrisikoen hvis gjenværende HMDS forblir på grunn av ufullstendig desiccation av prøven. Både PTA og PMA oppløst i etanol kan trygt brukes sammen med HMDS. PTA og PMA har vist seg å gi større oppløsningskraft av fine strukturer i ikke-mineraliserte mellomvirvelskiver sammenlignet med jodfarging38. Ved mikro-avbildning av pattedyrprøver har PTA og PMA blitt brukt til farging avmuseembryoer 39, mus kardiovaskulærsystem37, kaninmuskel og hjerne40, og pinnsvin41. PTA har høyere molekylmasse og tetthet i oppløsning enn PMA. Dette skyldes delvis en høyere atommasse av wolfram (atomnummer er 74 g/ mol), det viktigste dempingselementet i PTA. Til sammenligning har det tyngste elementet i PMA, molybden, et atomnummer på 42 g / mol. Både atommasse og prøvetetthet ligger til grunn for røntgendemping, i tillegg til prøvetykkelsen42. Røntgenbanelengden økes ved å øke prøvestørrelsene, og røntgendemping blir mer følsom for økt prøvetetthet. Derfor ble pma-kontrastagenten med lavere tetthet valgt for å redusere risikoen for overdemping og for å optimalisere det dynamiske spekteret av bildekontrast for hjerter i menneskelignende skala. Ytterligere bevis har vist at diffusjonsbelastning av PMA gir mer homogen farging enn for det større molekylet PTA i hjertevev43.
Metoden for levering av kontrastmiddel påvirker ensartetheten av kontrastmiddelfordeling i hjertevev (figur 3). Perfusjon av kontrastmidler i det etanol-dehydrerte hjertet viste lappete bakgrunnsfargingsnivåer av PMA på grunn av variabel vaskulær motstand. I det lufttørkede hjertet understrekes muskel laminærstrukturen av prøvetørkingsprosessen, noe som øker muskel laminær separasjon. Dette forbedret til slutt vevets generelle permeabilitet for diffusjonsbasert kontrastmiddelbelastning. Følgelig tilrettelegger lufttørking vev: luftkontrast på laminære og intralaminære nivåer (figur 4). Videre kan diffusjonslasting ytterligere lettes ved påføring under et vakuum. Det har videre vist seg at vevskrymping av ikke-tørkede prøver er avhengig av kontrastmiddelkonsentrasjon40. Imidlertid hemmer tidligere morfologisk stabilisering av prøven ved lufttørking vevskrympingseffekter29.
Mikro-CT-bilder med høy oppløsning av hele organer produserer iboende store datavolumer. Tomografiske bildeteknikker muliggjør visualisering og bildehåndtering stykke for stykke, noe som letter databehandlingen og minnebelastningen. For å visualisere tredimensjonale bildestakker, for eksempel for å gjengi prøvevolumer i tredimensjonale representasjoner, er de anbefalte minimumsspesifikasjonene for datamaskiner 128 GB RAM og en prosessorhastighet på 3 GHz. Solid-state-harddisker forbedrer også dataoverføringen betydelig.
Fremveksten av mikro-avbildning i hjertefeltet gir mange fordeler for translasjonsstudier og klinisk validering. Fordelene med sin tredimensjonale og mikrometriske avbildning har allerede vist anvendelser for å bestemme den trombotiske byrden av ST-høyde myokard iskemipasienter44,45. Kartlegging av potensielle kilder til arytmi hos strukturelle hjertesykdomspasienter er i stor grad avhengig av å bestemme fordelingen av fibrotisk arrvev og lokalisere sammenvevde spor av overlevende myokardium. Andrelinje tilnærminger for diagnostisering av ventrikulære arytmier bruker magnetisk resonansavbildning46. Den kan robust lokalisere tett fibrose, men er begrenset til lavoppløselig morfologisk karakterisering og gir begrenset innsikt i mikrostrukturell ombygging og diffuse fordelinger av fibrotiske lesjoner47. Høyoppløselig undersøkelse av arrfordeling og karakterisering har et stort potensial for å forbedre vår forståelse av hjertestrukturell ombygging og risikoen for å utvikle hjertesvikt. Spesielt vil grunnleggende forskningsstudier eller post-mortem undersøkelser dra nytte av bekreftende strukturelle bilder for elektrisk kartlegging av hjertearytmi.
Til slutt kan hjerter forsterket med HMDS-behandling og lufttørking senere farges med et røntgenkontrastmiddel for å forbedre røntgendempingen av ekstracellulære komponenter. Spesielt i sunt myokardium forekommer PMA-akkumulering ved epitelet, valvulært vev og rom i ventrikulært ledningssystem kledd av bindevev resulterte i forbedret røntgendemping. Videre, i strukturelt sykt myokardium, var forbedret kontrast ytterligere selektiv for fibrose.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien fikk økonomisk støtte fra den franske regjeringen som en del av “Investments of the Future” -programmet administrert av National Research Agency (ANR), Grant-referanse ANR-10-IAHU-04, og Leducq Foundation (RHYTHM-nettverket), samt Grant-referanse ANR-17-CE14-0029-01 [UNMASC], finansiering fra Det europeiske forskningsområdet for hjerte- og karsykdommer (ERA-CVD), tilskuddsreferanse H2020-HCO-2015_680969 [MultiFib] og finansiering fra den franske regionen Nouvelle Aquitaine, tilskuddsreferanser 2016 – 1R 30113 0000 7550/2016-1R 30113 0000 7553 og ANR-19-ECVD-0006-01.
10% neutral buffered formalin | Diapath | F0043 | |
Calcium chloride solution | Honeywell | 21114 | |
Canulation Tubing PTFE | VWR | DENE3400102 | |
Constant Head 1L Reservoir | Harvard Apparatus | 50-0496 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 796881 | |
Heparin sodium (5000 U/mL) | Panpharma | 3400891287301. | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma | 440191-1L | |
Hydrochloric acid, ACS reagent, 37% | Sigma | 258148 | |
Magnesium chloride solution | Honeywell | 63020 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368 | |
Phosphomolybdic acid hydrate | Fisher Scientific | 417895000 | |
Potassium Chloride | Sigma | P5405 | |
Pump Tubing, 3-Stop | Ismatec | FV-96328-48 | |
SkyScan, 1276 | Bruker | micro CT | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
Sodium hydroxide solution 50% in H2O | Sigma | 415413 | |
Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 72-1407 | |
Tubing pump | Ismatec | ISM 1089 | |
Tubing Tygon R-3603 1.6 mm 3.2 mm 0.8 mm | VWR | 228-1279 | |
Tubing Tygon R-3603 3.2 mm 4.8 mm 0.8 mm | VWR | 228-1283 | |
Two-part single-use syringes 50 mL | Norm-Ject | 4850001000 | Pyrogen-free, PVC-free |