この出版物は、カスタマイズ可能な光レジームを備えた実験室用フォトバイオリアクター(PBR)の設計について説明しています。シアノバクテリアまたは微細藻類の増殖は、炭酸水素塩を炭素源として使用し、体積酸素産生を測定することによって継続的に監視される。これらのPBRは、実験中のユーザーの介入をほとんど伴わずに、迅速で複製された実験室の成長比較を容易にします。
微細藻類の実験室研究は実験的に困難な場合があります。非光合成微生物の培養要件に加えて、光栄養はまた、照明を必要とする。日常的に、研究者はカスタムの光源、すなわちそれが供給される光強度と時間を変えようとします。このような柔軟性は、標準的なベンチトップライトでは困難です。通常、栽培研究は、実験的処置間の成長比較も必要とする。多くの場合、成長は、例えば、1週間にわたる試験にわたって1日に複数回、長期間にわたって評価される。手動測定は時間がかかり、データ分解能が不足する可能性があります。したがって、自動増殖モニタリングとカスタマイズ可能な光供給を備えたフォトバイオリアクター(PBR)は、複数の処理を伴う複製実験に有用である。現在の研究は、実験室PBRの設計、建設、および操作を提示する。材料は容易に調達され、比較的安価である。デザインは適度なスキルで複製することができます。各構造物のフットプリントは約40 cm2で、3 回の複製用に3本の1 Lガラス瓶をホストしています。ボトルはマグネチックスターラーを含むプラットフォームの上に置かれ、高さ1 m、直径15 cmのポリ塩化ビニル(PVC)パイプ内に垂直に配置されます。パイプ内部には発光ダイオード(LED)が並んでいます。これらのLEDは、光合成活性放射線(PAR)の0〜2400μmol光子m-2 s-1からの連続光強度を生成する。ユーザーはカスタム照明プログラムを設計します。光の強度は、毎秒調整することも、より長い期間一定に保持することもできます。光合成から生成された酸素は、一方向容積式ガスセンサーを介して各ボトルから出ます。ソフトウェアは、ガスセンサーのデータを記録するために使用されます。生成される酸素の量は、バイオマス成長と相関し得る。バイオマスサンプルが必要な場合は、シリンジを使用して培養物を抽出することができます。この方法は、重炭酸塩を炭素源として増殖させた微細藻類に適している。これらのPBRは、複製実験、光レジームの柔軟性、および継続的な高解像度成長データを必要とする研究室にとって貴重です。
微細藻類とシアノバクテリアは、簡単にするために微細藻類と総称され、持続可能なバイオテクノロジーにおけるその可能性のために擁護されています。彼らは、その急速な成長、耕作不可能な土地で栽培する能力、および二酸化炭素のバイオマスへの変換を促進するために日光を使用するため、魅力的な候補です1,2,3。微細藻類バイオマスは、石油またはガス、食品染料および栄養補助食品、ならびに生体高分子1,4,5,6,7などの材料の形でバイオエネルギーなどの製品に変換することができる。さらに、それらは排水を処理したり、過剰な栄養素を消費することによって水域を修復したりするために使用することができます 8,9.これを考えると、微細藻類の研究は広範かつ確立されています。この分野は、社会が現在の製造とエネルギー生成のアプローチの炭素強度と環境の持続可能性を再考するにつれて成長します。
実験室ベースの微細藻類研究の3つの基本的な要件は、培養容器、光源、および増殖を定量化する方法です。光バイオリアクター(PBR)という用語は、培養容器10が照明されるセットアップを記述する。一般に、微細藻類の研究は、2つ以上の処置、例えば、異なる成長培地、光レジーム、または種11、12、13の間の成長を比較することを目的としている。統計的関連性のために、各状態、例えば、治療および対照は、複製されるべきである。コントロールと治療を同時に実行する場合、実験期間中、多くのPBRをモニターおよびサンプリングする必要があります。複数のPBRを運用する場合の課題は2つあります。まず、各PBRに均一な光強度を供給することは、再現性のために不可欠ですが、困難な場合があります。容器表面に入射する光の量は、光源からの距離、隣接する容器からのシェーディング、および背景光変動14によって影響される。第二に、成長を正確に定量化する方法を選択する必要があります。
増殖は一般に、細胞数、光学密度(OD)、クロロフィルA含有量、乾燥重量(DW)密度、および無灰乾燥重量(AFDW)密度15によって測定される。細胞数、クロロフィルA含有量、および重量法は、離散的なデータポイントを生成する手動プロセスです。ODは、AFDW密度15などの別の方法に対して十分に較正されていれば、分光光度計を用いて連続的かつ非侵襲的に測定することができる。しかしながら、OD測定値およびクロロフィルA含量は、結果が異なる培養条件下、例えば、種間および成長サイクル全体を通して変化するため、信頼性が低い可能性がある15、16。クロロフィルAの場合、抽出方法は色素収率17にも影響を与えることができる。クロロフィルA含有量は、非光合成生物も含む微生物群集内の微細藻類の成長を追跡するのに特に有用である17、18。成長を決定する方法を選択する際には、懸濁液の形態を考慮することが不可欠である。生物が凝集し、十分に混合されていない場合、ODと細胞数は不可能です15。単一の方法がすべての実験用途に適しているわけではなく、研究者はどの方法が実用的で実験目的に関連しているかを決定する必要があります。
AFDWは、様々な培養条件間、特に種と培養培地との間の増殖比較を可能にする信頼できる方法である15、19、20。AFDWを計算するために、微細藻類培養物のサンプルを、まず、濾過または遠心分離のいずれかによって濃縮し、乾燥させる。この段階で、DW を決定することができます。通常、DWサンプルには、塩や粒子状物質などの灰質無機材料が少なくとも8〜10%含まれています15。DWは成長傾向を追跡しますが、無機物の寄与が異なる場合、歪む可能性があります。AFDW密度を決定するために、乾燥バイオマスを高温で燃焼させる。これは、19の後ろに灰(無機物)を残しながら、有機または有用な部分を気化させます。AFDWを計算するために、灰分率の重量をDW分率の重量から差し引く。典型的には、微細藻類懸濁液において、AFDWの範囲は0.1〜3g/L12,21,22である。少量の希薄懸濁液は、乾燥バイオマスをほとんどもたらさない、<10mgである。燃焼後、灰の重さはわずか1mgです。したがって、培養密度に応じて、この方法は5〜100mLの容量と0.1mg 12,15,19,22の正確な分析スケールを必要とします。実験室用PBRは通常、小さく、最大で数リットルであるため、すべての液体サンプルは培養量を枯渇させます。さらに、AFDW法は手動であり、2〜3日かかります。反復実験と反復実験では、自動化された連続的なプロセスが好ましい。
炭素源として重炭酸塩を使用する微細藻類の場合、2つの追加の成長メトリックを連続的に測定することができる。光合成は重炭酸塩を消費し、酸素を生成します。重炭酸塩の消費量は、中pH23を駆動します。浸漬pHプローブは、この変化を測定することができます。光合成酸素生成は、培地が飽和するまで培地の溶存酸素(DO)濃度を増加させる。飽和を超えて、酸素は気泡として存在します。酸素生成は、プローブがDO濃度を測定し、マノメトリックデバイスがヘッドスペースの圧力を評価し、ガスクロマトグラフィーがヘッドスペースの組成を測定し、体積センサーがガス流出24、25、26、27を記録するなど、さまざまな技術によって測定されます。酸素を増殖プロキシとして使用する場合、培養容器は完全に密閉されているか、ガスの流出のみを許可する必要があります。pHおよび酸素測定の場合、炭素はCO2散布ではなく、重炭酸塩の形で供給されなければなりません。CO2散布は培地pH23を低下させ、気体として酸素測定を妨げる可能性がある。光学密度に対するpHおよび酸素の利点の1つは、微細藻類が凝集塊を形成してもこの方法が損なわれないことである。間接的ではありますが、pHと酸素の両方が治療間の成長を比較するのに効果的です。
現在使用されている PBR は、複雑さがさまざまです。実験室では、単純なベンチトップフラスコ、カスタムプロトタイプ、または市販製品を使用できます。フラスコからのアップグレードを目指す研究グループにとって、多くのプロトタイプを構築するために必要な市販PBRのコストや技術的スキルと部品製造のコストが障壁になる可能性があります。この原稿は、このギャップを埋めるラボ用PBRの設計、構築、運用を段階的に説明することを目的としています。これらのPBRはカスタマイズ可能な光レジームを持ち、体積酸素産生を記録することによって成長を継続的に監視します。この設計には、3 つの複製用の 3 つの培養容器が収容されており、適度なスキルと簡単にアクセスできる材料で構築できます。このPBRは、非常に技術的または高価な製品に投資することなく、微細藻類研究の能力を拡大しようとしている研究室への貴重な追加です。PBRの取得または構築を選択する場合、研究者は、文化条件、財政状態、および研究上の質問に対する設計の適合性を考慮する必要があります。
このプロトコルでは、次の手順に重点を置くと、再現性のある高品質のデータを生成する可能性が高くなります。リアクタースタンドを構築するとき(ステップ1)、ベースは十分に整列された垂直支持体で頑丈でなければならない。スロット付きスチールは鋭いエッジを持っているので、安全キャップの追加は不可欠です。ボトルプラットフォームの表面は完全に平らである必要があり、マグネチックスターラーとボルトヘッドは両方とも最上層表面の下に配置する必要があります(ステップ3.2-3.6)。メーカーの指示によると、正確な酸素測定のために、ガスセンサーパッキング液を「液体レベルのトレーススクリュー」に充填する必要があります。この液体レベルは、パッキング液体の蒸発が測定セルを短絡させる可能性があるため、定期的にチェックする必要があります。ステップ 5.2 で製造された 3 つのガス ラインはすべて同じ長さにする必要があります。これは、複製が同じヘッドスペースボリュームを持つエヌアです。実験を開始する前に、24時間にわたって光強度を記録して、プログラムされた光レジームをテストすることをお勧めします(ステップ6.11)。液温の上昇が懸念される場合は、このテストには内部温度プローブを備えた密閉ボトルも含める必要があります(ステップ6.11)。ロギング時には、データ集録ソフトウェアのウィンドウを終了しないでください。これにより、ログ記録が終了します。培養サンプルを採取する場合は、間違った順序でバルブを開けてヘッドスペースガスを放出しないように注意してください(ステップ8.2-8.8)。実験データを確認するときは、データ収集ソフトウェアが自動的に流量の移動平均を生成することに注意してください。これにより、一晩で生成された1つまたは2つの流量測定値の値が膨らみます。ガスセンサーログを手動でキュレートしてこれを修正します。
この方法の最も一般的な欠点は、液体パッキングレベルが低下した場合にガスセンサを短絡させる可能性があることです。これには 2 つの方法があります。第一に、蒸発はゆっくりと液体レベルを低下させることができる。しかしながら、これは短期的(<7日間)の実験29では起こりそうもない。第二に、高い呼吸数は酸素を溶液に引き込み、ヘッドスペースの圧力低下を引き起こす可能性があります。光エネルギーが利用できない場合、微細藻類は好気呼吸を使用して、細胞の維持および修復に必要なエネルギーを供給する28。したがって、非照明時間中の高密度培養では、酸素消費量、および結果として生じる圧力下は相当なものになる可能性があります。これにより、ガスセンサーから梱包液がガスラインに吸い込まれます。パッキング液体が移動する距離は、夜間の呼吸量に比例します。包装液がボトルに入ると、液面に油膜が発生します。
夜間の高い呼吸数が予想される場合は、プロトコルを変更することができます。過少圧力を避ける最も簡単な方法は、ボトルのヘッドスペースを一晩開いたままにしておくことです。これはまた、O2の部分的なヘッドスペース圧力を低下させることによってDOレベルを緩和するという利点を有する。高いDO濃度は、O2がルビスコの活性を妨げ、酸化ストレスを引き起こす可能性があるため、成長に有害であると考えられている30、31。培養懸濁液が大気25,32と接触した場合でも4倍の過飽和に達することは珍しくない。ヘッドスペースを開くには、ゴム栓にまたがる針からガスラインを外します。夜間の時間は、ガスセンサーの梱包液を補充したり、データ収集にほとんど影響を及ぼさずに連続実験を操作したりするための窓として機能します。例えば、培養密度を変更したり、栄養素をリフレッシュしたり、修正を加えたり、病原体を導入したりすることができる。ボトルは再密封し、ガスセンサーラインを再接続してからライトが再び点灯する必要があります。夜間の閉鎖ヘッドスペースと開放ヘッドスペースの実験から収集された酸素測定値は異なります。
ボトルが密封されたままになると、夜間の酸素消費により、ヘッドスペース内のO2のモル数が減少します。これにより、梱包液がガスセンサーラインを這い上がり、ヘッドスペースの圧力を維持します。ライトが点灯すると、酸素生成が再開されます。流量の読み取りを開始する前に、梱包液をガスセンサーに押し戻す必要があります。したがって、この遅れは夜間の呼吸の程度に比例する。このようにして、ヘッドスペースが閉じたままのとき、O2読み取り値は正味のO2産生(光合成産生−呼吸消費)を表す。逆に、夜間にヘッドスペースが開いていると、ヘッドスペースO2が消費されるものに大気ガスが取って代わり、ガスライン内に充填液が入らない。その結果、呼吸O2消費はO2産生データでは考慮されない。これにより、AFDWバイオマス成長推定値の精度が低下する可能性があります。しかしながら、治療間の成長を比較するための指標として昼間のO2産生を使用することの有用性に影響を及ぼすべきではない。
すべての実験室PBRは同じ制限に悩まされています。人工光は太陽スペクトルを複製することはできません。微細藻類は、光合成のために400〜700nmの光の波長を使用する。この領域は、光合成活性放射線(PAR)33と呼ばれる。太陽光と人工光は、この範囲内で波長の相対的な寄与が異なります。これは、良好な温度と一定の光供給に加えて、実験室の成長データを屋外条件に確実に外挿できないことが多いことを意味します。ただし、これらのPBRは、実験室用PBRライト供給の限界の1つに対処することができます。日光の強度は1日を通して非常に変動し、雲量によって入射PARに一時的な変動が生じます。照明制御ソフトウェアとDMX照明コントローラは、0~2400μmolの光子m-2 s-1以降の光強度を提供できます。光のレジームは、1秒という短い個々の増分に分解することができます。調整可能な光強度により、ユーザーは標準のPBRセットアップよりも屋外の光パターンをより厳密に模倣できます。ここでは、シミュレートされた30分の夜明けと夕暮れの間隔が昼と夜のサイクルを一緒にフェードします(補足表1)。
AFDW密度は増殖の標準的な尺度となっていますが、この方法は、かなりの培養量、2〜3日間の処理期間を必要とし、一度に1つのデータポイントを生成する可能性があります。さらに、条件が悪くなり、細胞が死滅した場合、AFDW密度は、活発に光合成する細胞と分解している細胞とを区別しない。光合成酸素産生の速度を定量化することは、代替成長プロキシとして役立つ。このPBR設計は、培養量を節約しながら、ユーザーの介入をほとんど必要とせずに酸素生産を継続的に記録することができます。データ分解能は、測定セル容積の小さいガスセンサ(例えば、1mL)を選択することによって改善することができる。さらに、培養物がよく混合されている場合、ユーザーは連続的な光学密度測定値のために分光光度計を設置することを決定することができる。媒体の温度制御が必要な場合は、再循環チラーを追加することができます。これらのPBRは、多額の財政的投資なしに微細藻類研究能力を拡大しようとしている研究所にとって貴重な追加です。それらは、 スピルリナのような高アルカリ度、高pH種を扱う人々に特に適しています。これらのPBRは、光レジームの柔軟性を提供し、迅速で複製された実験室の成長比較に有効です。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、自然科学・工学研究評議会(NSERC)、カナダイノベーション財団(CFI)、カナダ・ファースト・リサーチ・エクセレンス・ファンド(CFREF)、アルバータ・イノベーツ、ジェネラル・サー・ジョン・モナッシュ財団、アルバータ州政府、カルガリー大学の支援を受けた。電気工事のマーク・トゥーネンと溶解度計算のウィリアム・リチャードソンに感謝します。
Aluminum channels Imperial: 0.90” x 39.37” Metric: 2.3 cm x 100 cm Quantity: 4 |
LED World | AC-AR1-1M | Required as a heat sink |
Bungee cords, small Quantity: 5 |
– | – | To secure bottles |
Computer – desktop/laptop Quantity: 1 |
– | – | – |
Data Logger, HOBO U30 USB Weather Station Quantity: 1 |
HOBO, Hoskin | U30-NRC-VIA-10-S100-000 | Records light sensor information |
Digital interface module, Rigamo, 4-channel Quantity: 1 |
Ritter | N/A | This is to transmit gas sensor data to the computer |
DMX decoder, 12~24 VDC, DMX-CV-4X5A Quantity: 1 |
LITECH, LED World | LT-840-6A | Transmit messages which alter the light pattern |
DMX lighting controller, SUSHI-RB-RJ Quantity: 1 |
Arcolis, Nicolaudie America Inc. | SUSHI-RB-RJ DMX | Encodes the lighting program |
Gas sensor packing liquid (Silox) Quantity: 1 L |
Ritter | https://www.ritter.de/en/data-sheets/silox | |
Gas sensor, volumetric Quantity: 3 |
Ritter | MGC-1 V3.4 PMMA (https://www.ritter.de/downloads/mgc-milligascounter-en) | Measures oxygen production |
Glass bottles, round 1 L with GL45 neck Quantity: 3 |
Corning, Capitol Scientific | 1395-1L | Culture vessels |
Hardware – end caps for slotted steel Quantity: 10 |
Paulin, Home Depot | 142-612 | To cover sharp edges of slotted steel |
Hardware – eye hooks Quantity: 6 |
– | – | To secure bottles |
Hardware – metal corner braces (large) Imperial: 4" x 4" Metric: 10 cm x 10 cm Quantity: 8 |
– | – | Larger brackets to construct metal stand |
Hardware – metal corner braces (small) Imperial: 2 1/2" x 2 1/2" Metric: 6.4 cm x 6.4 cm Quantity: 6 |
– | – | Small brackets to connect bottle platforms to PVC pipe |
Hardware – metal corner gussets Imperial: 3" x 3" Metric: 7.6 cm x 7.6 cm Quantity: 6 |
Paulin, Home Depot | 142-616 | Flat brackets to construct metal stand |
Hardware – piano hinge Imperial: 36" Metric: 91 cm Quantity: 1 |
– | – | Connects two halves of PVC pipe |
Hardware – rivets Quantity: 40 |
– | – | To attach piano hinge to PVC tubing |
Hardware – set of bolts, nuts, washers Quantity: 60 |
– | – | Long thin bolts are required to secure bottle platforms around magentic stirrers |
Hardware – set of bolts, nuts, washers Quantity: 30 |
– | – | Larger shorter bolts are required to build the metal stand |
LED driver, constant voltage, 96W 24VDC UL Listed IP65 Driver Class 2 regulated power supply Quantity: 1 |
Magnitude Lighting, LED World | CVN96L24DC | Regulates power to the lights |
LED lights, Cinco Bright LED Flex Strip Quantity: 4 m roll |
EvenBright, LED World | FA128M57-4M-24V-X | Roll is trimmed into 4 x 1 m lengths and secured inside the PVC tube |
Light meter, handheld with submersible sperical probe Quantity: 1 |
LI-COR | LA-250A | Calibrate the reactors light intensity |
Light sensors Photosynthetic Light (PAR) Smart Sensor Quantity: 2 |
HOBO, Hoskin | S-LIA-M003 | Only one is required however two would be good practice in case one malfunctioned |
Magnetic stirrers (MIXdrive 1 XS) with external control units and power supply (MIXcontrol eco) Quantity: 3 |
2Mag, 2MAG USA | MF 40300 | Stirrers sit sandwiched in bottle platforms |
Metal plate Imperial: 24" x 8" Metric: 61 cm x 20.3 cm Quantity: 1 |
– | – | This is a surface on which to secure electronics, it is attached to the back of the reactor |
Pipe, white PVC Imperial: 6" diameter x 42" high Metric: 15.2 cm x 106.7 cm Quantity: 1 |
– | – | Cut lengthwise in two halves, used to house lights and bottles |
Plastic (HDPE) sheets Imperial: 4" x 4" x 1/4" Metric: 10 cm x 10 cm x 1 cm Quantity: 6 |
Inventables | 30291-01 | For bottle platforms which house magentic stirrers |
Rubber stoppers – GL45 size Quantity: 3 |
Duran, VWR | 76289-760 | Seals culture vessels |
Screw caps – with aperture and GL45 neck Quantity: 3 |
Corning, Capitol Scientific | 1395-45HTSC | Generates seal of culture vessels |
Slotted angle steel lengths Imperial: 1-1/2" X 48" x 0.074" Metric: 3.8 cm x 122 cm x 0.19 cm Quantity: 6 |
Paulin, Home Depot | 142-202 | Makes up the body of the metal stand |
Slotted flat steel lenghts Imperial: 1-3/8" x 48" x 0.074" Metric: 3.5 cm x 122 cm x 0.19 cm Quantity: 3 |
Paulin, Home Depot | 142-222 | Makes up the body of the metal stand |
Software – Easy Stand Alone (ESA) | https://www.dmxsoft.com/#apps | AKA LED control software | |
Software – Rigamo v3.1 | AKA data acquisition software | ||
Software – Storage Upgrade Tools (SUT) | https://store.dmxsoft.com// | ||
Stir bar Imperial: 1" x 5/16" Metric: 2.5 cm x 0.8 cm Quantity: 3 |
Fisherbrand | 14-513-59 | Stirs culture |
Switch box Quantity: 1 |
– | – | Turns power on/off to reactor |
Syringe, 10 mL Quantity: Multiple |
– | – | Optional if you wish to extract culture |
Tube adaptor fittings, plastic – Stopcock 1-way Quantity: 6 |
Masterflex, Cole Palmer | RK-12023-33 | Close/open culture vessel line |
Tube adaptor fittings, plastic – variety of male and female luer lock fittings Imperial: to fit 1/16" and 1/8" ID tubing Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing Quantity: Multiple packets |
Masterflex, Cole Palmer | RK-30800-16; RK-30800-18; RK-45518-26; RK-45501-00; RK-45501-04 | Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings |
Tube adaptor fittings, plastic – variety of straight connectors Imperial: to fit 1/16" and 1/8" ID tubing Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing Quantity: Multiple packets |
Masterflex, Cole Palmer | RK-40616-04 | Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings |
Tubing, flexible, transparent Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm Quantity: 4 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06422-02 | Line from culture vessel to gas sensor |
Tubing, flexible, transparent Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm Quantity: 2 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06422-05 | Gas sensor standard tubing size |
Tubing, rigid, transparent Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm Quantiy: 1 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06605-27 | Spans rubber stopper allowing gas to exit |
Tubing, rigid, transparent Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm Quantity: 1 m |
Masterflex, Cole Palmer | RK-06605-30 | Spans rubber stopper allowing gas to exit |
Zip ties, small Quantity: 1 packet |
Secure tube fittings |