Direkte omprogrammering av musfibroblaster til Melanocytes
Summary
Her beskriver vi et optimalisert direkte omprogrammeringssystem for melanocytter og et høyeffektivt, konsentrert virusemballasjesystem som sikrer jevn direkte omprogrammering.
Abstract
Tap av funksjon av melanocytter fører til vitiligo, noe som alvorlig påvirker den fysiske og mentale helsen til de berørte individene. For tiden er det ingen effektiv langsiktig behandling for vitiligo. Derfor er det viktig å utvikle en praktisk og effektiv behandling for vitiligo. Regenerativ medisinteknologi for direkte omprogrammering av hudceller til melanocytter ser ut til å være en lovende ny behandling av vitiligo. Dette innebærer direkte omprogrammering av pasientens hudceller til funksjonelle melanocytter for å bidra til å forbedre tapet av melanocytter hos pasienter med vitiligo. Denne metoden må imidlertid først testes på mus. Selv om direkte omprogrammering er mye brukt, er det ingen klar protokoll for direkte omprogrammering til melanocytter. Videre er antall tilgjengelige transkripsjonsfaktorer overveldende.
Her presenteres en konsentrert lentivirusemballasjesystemprotokoll for å produsere transkripsjonsfaktorer valgt for omprogrammering av hudceller til melanocytter, inkludert Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 og Snai2. Mus embryonale fibroblaster (MEFer) ble infisert med konsentrert lentivirus for alle disse transkripsjonsfaktorene for direkte omprogrammering av MEF-ene til induserte melanocytter (iMels) in vitro. Videre ble disse transkripsjonsfaktorene screenet, og systemet ble optimalisert for direkte omprogrammering til melanocytter. Uttrykket av de karakteristiske markørene til melanin i iMels på gen- eller proteinnivå ble betydelig økt. Disse resultatene tyder på at direkte omprogrammering av fibroblaster til melanocytter kan være en vellykket ny terapeutisk strategi for vitiligo og bekrefte mekanismen for melanocyttutvikling, noe som vil gi grunnlag for videre direkte omprogrammering av fibroblaster til melanocytter in vivo.
Introduction
Vitiligo er en hudsykdom som alvorlig påvirker den fysiske og mentale helsen til de berørte individene. Av ulike grunner, inkludert metabolske abnormiteter, oksidativt stress, generering av inflammatoriske mediatorer, celleavløsning og autoimmun respons, går de funksjonelle melanocyttene tapt, og sekresjonen av melanin stoppes, noe som fører til utvikling av vitiligo 1,2. Denne tilstanden oppstår mye og er spesielt problematisk i ansiktet. Hovedbehandlingen er systemisk bruk av kortikosteroider og immunmodulatorer. Fototerapi kan brukes til systemiske eller lokale sykdommer, og det er kirurgiske behandlinger, for eksempel perforert hudtransplantasjon og autolog melanocyttransplantasjon 3,4,5. Imidlertid er pasienter som bruker medikamentell terapi og fototerapi utsatt for tilbakefall, og disse behandlingene har dårlige langsiktige terapeutiske effekter. Kirurgisk behandling er traumatisk og bare moderat effektiv 2,6. Derfor er det nødvendig med en ny og effektiv terapeutisk strategi for vitiligo.
Omprogrammeringen av induserte pluripotente stamceller (iPSCer) reverserer disse cellene fra terminaltilstanden til en pluripotent tilstand, en prosess formidlet av transkripsjonsfaktorene, Oct4, Sox2, Klf4 og c-Myc7. Men på grunn av muligheten for tumorigisitet og lang produksjonstid, har denne teknologien blitt møtt med skepsis når den brukes på kliniske innstillinger8. Direkte omprogrammering er en teknologi som gjør at én type terminalcelle forvandles til en annen type terminalcelle9. Denne prosessen oppnås ved egnede transkripsjonsfaktorer. Ulike celler har allerede blitt direkte omprogrammert vellykket, inkludert kardiomyocytter10, nevroner11 og cochleahårceller12. Noen forskere har til og med omprogrammert hudvev direkte in situ, som kan brukes til sårreparasjon13. Fordelene med direkte omprogrammering inkluderer reduserte ventetider og kostnader, lavere risiko for kreft, færre etiske problemer og en bedre forståelse av mekanismen som ligger til grunn for celle skjebnebestemmelse9.
Selv om den direkte omprogrammeringsmetoden er mye brukt, er det for tiden ingen bestemt metode for direkte omprogrammering av hudceller til melanocytter, spesielt på grunn av de mange transkripsjonsfaktorene som skal betraktes som14,15. Transkripsjonsfaktorene Mitf, Sox10 og Pax3 har blitt brukt til direkte omprogrammering av hudceller til melanocytter14. Kombinasjonen av MITF, PAX3, SOX2 og SOX9 har derimot også blitt brukt til direkte omprogrammering av hudceller til humane melanocytter i en annen studie15. I denne protokollen, til tross for bruk av en annen screeningmetode, ble det samme resultatet oppnådd med kombinasjonen av Mitf, Sox10 og Pax3 for direkte omprogrammering av hudceller til melanocytter som beskrevet tidligere14. Å utvikle et system for å generere melanocytter fra andre hudceller kan gi en ordning for å transformere andre hudceller av vitiligo-pasienter til melanocytter. Derfor er det avgjørende å konstruere en enkel og effektiv metode for denne direkte omprogrammeringen for å generere melanocytter med hell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kvaliteten på viruset er avgjørende for suksessen med direkte omprogrammering til melanocytter i denne protokollen. Metoden for pakking og konsentrerende virus i denne protokollen er enkel og enkel å gjenta og er ikke avhengig av noe annet ekstra konsentrert reagens. Denne protokollen kan følges i de fleste laboratorier. For å sikre kvaliteten på det konsentrerte viruset, trenger følgende punkter spesiell oppmerksomhet. Den ene er cellestatusen til HEK-293T. Selv om HEK-293T-celler er udødelige celler, må cellen…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble delvis støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (82070638 og 81770621) og Natural Science Foundation of Jiangsu-provinsen (BK20180281).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
Riferimenti
- Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. Vitiligo. Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).
- Picardo, M., et al. Vitiligo. Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011 (2015).
- Speeckaert, R., van Geel, N. Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).
- Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).
- Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. Surgical therapies for vitiligo. Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).
- Bishnoi, A., Parsad, D. Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments. International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).
- Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success. Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).
- Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).
- Kurita, M., et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue. Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nature Communications. 5, 5807 (2014).
- Fehrenbach, S., et al. Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage. Scientific Reports. 6, 28891 (2016).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).
- Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
- Donaldson, J. G. Immunofluorescence staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
