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Articolo metodologico

Determinazione della respirazione mitocondriale e della glicolisi in campioni di tessuto retinico Ex Vivo

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⸱

DOI:

10.3791/62914

⸱

4 agosto 2021

 ,  , 
1Neurobiology, Neurodegeneration & Repair Laboratory, National Eye Institute, National Institutes of Health

In questo articolo

Sommario

Qui è descritto un protocollo dettagliato per l'esecuzione del test dello stress mitocondriale e del test della velocità glicolitica in campioni di tessuto retinico ex vivo utilizzando un bioanalizzatore commerciale.

Abstract

La respirazione mitocondriale è una via critica che genera energia in tutte le cellule, in particolare i fotorecettori della retina che possiedono un metabolismo altamente attivo. Inoltre, i fotorecettori mostrano anche un'elevata glicolisi aerobica come le cellule tumorali. Misurazioni precise di queste attività metaboliche possono fornire preziose informazioni sull'omeostasi cellulare in condizioni fisiologiche e negli stati patologici. Sono stati sviluppati saggi basati su micropiastre ad alto rendimento per misurare la respirazione mitocondriale e varie attività metaboliche nelle cellule vive. Tuttavia, la stragrande maggioranza di questi sono sviluppati per cellule in coltura e non sono stati ottimizzati per campioni di tessuto intatto e per l'applicazione ex vivo. Qui è descritto un protocollo dettagliato passo-passo, che utilizza la tecnologia di fluorescenza basata su micropiastre, per misurare direttamente il tasso di consumo di ossigeno (OCR) come indicatore della respirazione mitocondriale, nonché il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) come indicatore di glicolisi, nel tessuto retinico ex vivo intatto. Questo metodo è stato utilizzato per valutare con successo le attività metaboliche nella retina del topo adulto e dimostrare la sua applicazione nello studio dei meccanismi cellulari dell'invecchiamento e della malattia.

Introduzione

I mitocondri sono organelli essenziali che regolano il metabolismo cellulare, la segnalazione, l'omeostasi e l'apoptosi coordinando molteplici processi fisiologici cruciali1. I mitocondri fungono da centrale elettrica nella cellula per generare adenosina trifosfato (ATP) attraverso la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) e fornire energia che supporta quasi tutti gli eventi cellulari. La maggior parte dell'ossigeno cellulare viene metabolizzato nei mitocondri, dove funge da accettore finale di elettroni nella catena di trasporto degli elettroni (ETC) durante la respirazione aerobica. Basse quantità di ATP possono anche essere prodotte dalla glicolisi nel citosol, dove il glucosio viene convertito in piruvato, che può essere ulteriormente convertito in lattato o trasportato nei mitocondri e ossidato in acetil-CoA, un substrato nel ciclo dell'acido tricarbossilico (ciclo TCA).

La retina è uno dei tessuti metabolicamente più attivi nei mammiferi2, che mostra alti livelli di respirazione mitocondriale e un consumo di ossigeno estremamente elevato3. I fotorecettori a bastoncello e cono contengono un'alta densità di mitocondri4 e OXPHOS genera la maggior parte dell'ATP nella retina5. Inoltre, la retina si basa fortemente sulla glicolisi aerobica6,7 convertendo il glucosio in lattato5. I difetti mitocondriali sono associati a varie malattie neurodegenerative8,9; e con le sue elevate richieste energetiche uniche, la retina è particolarmente vulnerabile ai difetti metabolici, compresi quelli che colpiscono OXPHOS4 mitocondriale e glicolisi10. La disfunzione mitocondriale e i difetti della glicolisi sono implicati nelle malattie degenerative della retina11,12 e macular13, nella degenerazione maculare legata all'età10,14,15,16 e nella retinopatia diabetica17,18. Pertanto, misurazioni accurate della respirazione mitocondriale e della glicolisi possono fornire parametri importanti per valutare l'integrità e la salute della retina.

La respirazione mitocondriale può essere misurata attraverso la determinazione del tasso di consumo di ossigeno (OCR). Dato che la conversione del glucosio in piruvato e successivamente in lattato provoca l'estrusione di protoni e l'acidificazione dell'ambiente extracellulare, le misurazioni del tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) forniscono un'indicazione del flusso di glicolisi. Poiché la retina è composta da più tipi di cellule con relazioni intime e sinergia attiva, incluso lo scambio di substrati6, è imperativo analizzare la funzione mitocondriale e il metabolismo nel contesto dell'intero tessuto retinico con laminazione e circuiti intatti. Negli ultimi decenni, gli elettrodi O2 di tipo Clark e altri microelettrodi di ossigeno sono stati utilizzati per misurare il consumo di ossigeno nella retina19,20,21. Questi elettrodi di ossigeno hanno importanti limitazioni nella sensibilità, nella necessità di un grande volume di campione e nella necessità di un'agitazione continua del campione sospeso, che di solito porta alla rottura del contesto cellulare e tissutale. Il protocollo qui descritto è stato sviluppato utilizzando una tecnica di fluorescenza basata su micropiastre per misurare il metabolismo energetico mitocondriale nel tessuto retinico di topo ex vivo appena sezionato. Consente misurazioni in tempo reale a medio rendimento di OCR ed ECAR contemporaneamente utilizzando un piccolo campione (punzone da 1 mm) di tessuto retinico ex vivo, evitando la necessità di sospensione e agitazione continua.

Qui è dimostrata la procedura sperimentale per il test dello stress mitocondriale e il test della velocità glicolitica su dischi di punzonatura retinica appena sezionati. Questo protocollo consente la misurazione delle attività metaboliche correlate ai mitocondri in un contesto tissutale ex vivo. A differenza dei saggi eseguiti utilizzando cellule in coltura, le letture qui ottenute riflettono il metabolismo energetico combinato a livello tissutale e sono influenzate dalle interazioni tra i diversi tipi di cellule all'interno del tessuto. Il protocollo è stato modificato da una versione precedentemente pubblicata22,23 per adattarsi alla nuova generazione dell'analizzatore a flusso extracellulare a 24 pozzetti Agilent Seahorse (XFe24) con piastra Islet Capture. Anche il mezzo di dosaggio, le concentrazioni del composto di iniezione e il numero/durata dei cicli di analisi sono stati ottimizzati per il tessuto retinico. Viene fornito un protocollo dettagliato passo-passo per la preparazione dei dischi di punzonatura retinica. Ulteriori informazioni sulla configurazione del programma e sull'analisi dei dati possono essere ottenute dalla guida per l'utente del produttore24,25,26.

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Protocollo

Tutti i protocolli del topo sono stati approvati dall'Animal Care and Use Committee del National Eye Institute (NEI ASP# 650). I topi sono stati alloggiati in condizioni di luce-buio di 12 ore e curati seguendo le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, l'Istituto delle risorse animali da laboratorio e la politica del servizio sanitario pubblico sulla cura umana e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Cartuccia del sensore idratante e preparazione del mezzo di saggio

  1. Il giorno prima dell'esperimento, aggiungere 1 mL del mezzo di calibrazione a ciascun pozzetto della piastra di utilità. Posizionare il coperchio Hydro-Booster sulla parte superiore e abbassare la cartuccia del sensore attraverso l'apertura sul coperchio. Verificare che il sensore sia immerso nel mezzo di calibrazione. Incubare la cartuccia del sensore durante la notte in un incubatore privo di CO2 a 37 °C per attivare i fluorofori.
    NOTA: per evitare l'evaporazione, l'incubatore viene umidificato mantenendo un vassoio d'acqua all'interno e la cassetta della cartuccia del sensore viene avvolta con un involucro di plastica trasparente.
  2. Preparare il mezzo di analisi ricostituendo il mezzo DMEM di cavalluccio marino con l'aggiunta di glucosio, piruvato e glutammina alle concentrazioni desiderate. Nei saggi riportati in questo articolo, la concentrazione finale dei substrati nel mezzo di saggio è: 6 mM di glucosio, 0,12 mM di piruvato e 0,5 mM di glutammina. Per ogni piastra di analisi, 40 ml del mezzo di saggio vengono preparati freschi il giorno dell'esperimento.
  3. Impostare il programma di analisi nell'analizzatore seguendo le istruzioni del produttore26. Nel test qui dimostrato, il protocollo è impostato come segue: 5 cicli di misurazioni per la linea di base, quindi iniettare la porta A, seguita da 4 cicli di misurazioni, quindi iniettare la porta B e seguita da 4 cicli di misurazioni. Ogni ciclo è composto da mix (3 min), attesa (2 min) e misura (3 min).

2. Rivestimento di inserti a rete di micropiastra di cattura isolotto

  1. Preparare la miscela di rivestimento combinando 20 μL del mezzo di attacco cellulare (ad esempio, Cell-Tak) con 171 μL di bicarbonato di sodio 0,1 M e 9 μL di 1 M NaOH.
  2. Aprire il coperchio della cassetta contenente inserti a rete. Pipetta 8 μL della miscela di rivestimento per ogni inserto di rete. Utilizzare una punta della pipetta per spalmare / distribuire delicatamente la goccia intorno per distribuire equamente la miscela di rivestimento in tutto l'inserto a rete.
  3. Chiudere la cassetta e lasciare incubare gli inserti a rete a temperatura ambiente per almeno 25 minuti per adsorbimento.
  4. Lavare l'inserto a rete pipettando 4 mL del mezzo di dosaggio direttamente sugli inserti a rete. Agitare delicatamente la cassetta per assicurarsi che tutti gli inserti in rete vengano lavati con il mezzo di analisi.
  5. Tenere da parte l'inserto in mesh. È pronto all'uso.

3. Preparazione dei composti per iniezione

  1. Estrarre aliquote di riserva di Bam15 (10 mM), Rotenone (10 mM), Antimicina A (10 mM) e 2-DG (500 mM) da congelatore -80 °C e scongelare a temperatura ambiente.
    NOTA: lo stock 2-DG è pronto per l'uso. Gli altri farmaci devono essere diluiti in scorte di lavoro.
  2. Riscaldare 10 mL del mezzo di saggio a bagnomaria a 37 °C.
  3. Diluire 10 mM Bam15 stock a 50 μM di stock di lavoro utilizzando una procedura di diluizione in due fasi: mescolare 20 μL di 10 mM stock con 20 μL di DMSO per ottenere 5 mM di stock intermedio. Quindi mescolare 10 μL del materiale intermedio sopra di 5 mM con 990 μL di mezzo di saggio preriscaldato per ottenere lo stock di lavoro finale di 50 μM.
  4. Diluire e combinare 10 mM Rotenone e 10 mM Antimycin A stock a 10 μM Rotenone/Antimycin A (Rot/AA) stock di lavoro con due fasi di diluizioni: mescolare 10 μL ciascuno di 10 mM Rotenone e 10 mM Antimycin A stock con 80 μL di DMSO per ottenere 1 mM Rot/AA stock intermedio. Quindi mescolare 10 μL del materiale intermedio di cui sopra 1 mM con 990 μL di mezzo di saggio preriscaldato per ottenere lo stock finale di rot/AA da 10 μM.
  5. Preparare al momento le scorte di lavoro sopra menzionate di composti di iniezione il giorno dell'esperimento e metterle da parte a temperatura ambiente fino al caricamento nelle porte di iniezione della cartuccia del sensore.

4. Dissezione retinica e preparazione del punch retinico

  1. Eutanasia di un topo mediante asfissia di CO2 seguendo le linee guida AVMA sull'eutanasia27.
    NOTA: Non lasciare l'animale in una camera di CO2 più a lungo del tempo necessario per l'eutanasia.
  2. Enucleare gli occhi e metterli in un tampone PBS 1x vecchio di ghiaccio in una capsula di Petri e poi metterlo sotto un microscopio di dissezione.
  3. Rimuovere con cura, tagliando con microscissori, i muscoli retti extra attaccati all'esterno del bulbo oculare e tagliare il nervo ottico.
  4. Utilizzare un ago da 30 G per perforare un foro sul bordo della cornea (limbus); questo funge da sito di inserimento per i microscissori. Quindi, utilizzare un microscissore a dissezione fine per effettuare un taglio circolare lungo il bordo della cornea, separandolo dal padiglione oculare posteriore.
  5. Usa una pinza di dissezione affilata per rimuovere la cornea, la lente e l'umore vitreo lontano dalla coppa dell'occhio.
  6. Utilizzare microscissori a dissezione fine per effettuare diversi piccoli tagli sullo strato sclerale sul bordo della coppa oculare. Evitare di tagliare lo strato di retina. Utilizzare due pinze di dissezione affilate per trattenere il tessuto sclerale su ciascun lato del taglio e tirare con molta attenzione lo strato sclerale per rimuoverlo dalla retina neurale. Ripeti questo intorno alla coppa dell'occhio fino a quando tutta la sclera viene rimossa e si ottiene una coppa retinica intatta.
  7. Utilizzare microscissori di dissezione e fare tagli radiali sulla tazza retinica per appiattirla e generare diverse sezioni distinte.
    NOTA: A seconda delle capacità di dissezione della persona e dell'esperienza nella gestione del tessuto retinico fresco, la tazza retinica può essere tagliata per generare da 3 a 5 sezioni distinte.
  8. Utilizzare un perforatore per biopsia di 1 mm di diametro per tagliare un disco retinico da ciascuna sezione della tazza retinica appiattita.
    NOTA: Bisogna fare attenzione a ottenere i dischi retinici perforati a uguale distanza dalla testa del nervo ottico.
  9. Utilizzare una pinza per trasferire gli inserti in rete preverniciati nella capsula di Petri di dissezione. Con l'aiuto di due pennelli per ciglia superfini, posizionare il disco di punzonatura retinica sull'inserto a rete. Il disco di punzonatura retinica è posto al centro dell'inserto della rete con lo strato di cellule gangliari rivolto verso il basso che tocca la rete e lo strato di fotorecettore rivolto verso l'alto.
    NOTA: Spesso, alcune cellule RPE rimangono attaccate ai fotorecettori e la pigmentazione di queste cellule può essere utilizzata come indicatore dell'orientamento del disco di perforazione retinica.

5. Caricamento delle porte di iniezione della cartuccia del sensore e calibrazione

  1. Estrarre la cassetta della cartuccia del sensore idratata dall'incubatore a 37 °C. Rimuovere il coperchio Hydro-Booster e riposizionare la cartuccia del sensore sulla piastra di servizio.
  2. Caricare il volume desiderato di soluzioni di stock di lavoro composto per iniezione in porte appropriate. Tenere la punta della pipetta con un angolo di 45 °. Inserire la punta della pipetta a metà strada in una porta di iniezione con la smussatura della punta contro la parete opposta della porta di iniezione e caricare delicatamente il composto in ciascuna porta. Evitare di introdurre bolle d'aria.
  3. Fare riferimento alla guida per l'utente dello strumento per il volume del composto caricato in ciascuna porta di iniezione per un test specifico. Negli esperimenti presentati in questo articolo, 68 μL di 50 μM Bam15 (per il saggio di stress mitocondriale) o 68 μL di 10 μM Rot/AA di stock di lavoro (per il saggio della velocità glicolitica) vengono caricati nella porta A; 75 μL di 10 μM rot/AA (per il saggio di stress mitocondriale) o 75 μL di 500 mM di stock di lavoro 2-DG (per il saggio della velocità glicolitica) vengono caricati nella porta B.
  4. Porte di iniezione del carico di tutti i pozzetti della piastra, compresi i pozzetti di correzione di fondo e i pozzetti vuoti per garantire una corretta iniezione. Caricare la rispettiva soluzione composta in ogni porta per i pozzetti di correzione dello sfondo. Il mezzo di saggio può essere sostituito, invece della soluzione composta, in ciascuna delle porte dei pozzi bancari.
  5. Posizionare la piastra della cartuccia del sensore caricata, con il coperchio spento, nella macchina dell'analizzatore per avviare la calibrazione prima dell'esecuzione del test. Al termine della calibrazione, il programma si fermerà automaticamente, in attesa della sostituzione della piastra di utilità con la piastra di cattura dell'isolotto contenente punzoni retinici.

6. Caricamento della piastra di cattura dell'isolotto e avvio dell'esecuzione del test

  1. Aggiungere 607 μL del mezzo di analisi a ciascun pozzetto della piastra di cattura dell'isolotto
  2. Utilizzare una pinza per afferrare il bordo dell'inserto a rete contenente dischi di punzonatura retinica sulla parte superiore ed estrarlo dalla capsula di Petri. Picchiettare leggermente il fondo dell'inserto a rete su un tessuto assorbente per rimuovere il liquido extra e metterlo nel pozzetto della piastra di cattura dell'isolotto. Ripetere questo passaggio fino a quando tutti gli inserti a rete con punzoni retinici vengono inseriti nella piastra di cattura dell'isolotto. Riempire i pozzetti di correzione dello sfondo e i pozzetti vuoti con inserti mesh vuoti.
  3. Utilizzare due pinze Graefe per premere con attenzione e delicatezza il bordo di ciascun inserto in mesh e assicurarsi che questi siano inseriti saldamente nella parte inferiore della piastra di cattura dell'isolotto.
  4. Posizionare la piastra di cattura dell'isolotto caricata in un incubatore a 37 °C per 5 minuti per riscaldarsi.
  5. Espellere la piastra di utilità al termine della calibrazione e sostituirla con una e sostituirla con la piastra di cattura dell'isolotto, con coperchio spento, contenente punzoni retinici.
  6. Riprendere l'esecuzione del test.

7. Esegui la terminazione e l'archiviazione dei dati

  1. Al termine dell'esecuzione, espellere la cartuccia del sensore e la piastra di cattura dell'isolotto contenente punzoni retinici. I dati vengono salvati automaticamente come file .asyr.
  2. Utilizzare il software di analisi dei dati associato per visualizzare e analizzare i dati seguendo la guida per l'utente del produttore26.
  3. Utilizzare la funzione Esporta per esportare il file .xslx dei dati, che può essere visualizzato e analizzato utilizzando un software per fogli di calcolo.

8. Salvataggio del campione di punzonatura retinica

  1. Dopo il test, estrarre la piastra dalla macchina, rimuovere la cartuccia del sensore e rimuovere delicatamente il mezzo di dosaggio da ciascun pozzetto utilizzando una pipetta.
  2. Applicare nuovamente il coperchio e sigillare i lati della piastra con la striscia di parafilm.
  3. Conservare a -80 °C.
  4. Per la normalizzazione, quantificare il DNA totale o il contenuto proteico del pugno in ciascun pozzetto.

9. Analisi dei dati

  1. Test dello stress mitocondriale
    NOTA: il valore OCR misurato (totalOCR) rappresenta il consumo totale di ossigeno da parte del tessuto. Dopo l'iniezione di Bam15 (uncoupler), l'OCR aumenta dal livello basale (totalOCRbasal) al livello massimo (totalOCRmax) e diminuisce dopo l'iniezione di Rot/AA. Il valore residuo di OCR dopo iniezione di Rot/AA (totalOCRRot/AA) rappresenta il consumo di ossigeno non mitocondriale.
    1. Calcola il consumo di ossigeno correlato ai mitocondri come:
      figure-protocol-1 (Eq. 1) 28 anni
    2. Calcola la capacità di riserva mitocondriale (MRC) come:
      figure-protocol-2 (Eq. 2) 29 anni
      NOTA: L'ultima lettura tra le 5 misurazioni prima dell'iniezione di Bam15 viene presa come valore "basale" (per totalOCRbasal e mitoOCRbasal). La lettura più alta tra le 4 misurazioni successive all'iniezione di Bam15 viene utilizzata come valore "max" (per totalOCRmax e mitoOCRmax). La lettura più bassa tra le 4 misurazioni successive all'iniezione di Rot/AA viene utilizzata come totalOCRRot/AA.
  2. Saggio della velocità glicolitica
    NOTA: Il valore ECAR misurato (totalECAR) rappresenta l'acidificazione totale del mezzo da parte dell'attività metabolica del tessuto. In generale, l'acidificazione del microambiente extracellulare risulta principalmente per estrusione del prodotto glicolitico, il lattato. Il catabolismo dei substrati nel ciclo TCA mitocondriale determina la produzione di CO2, che acidifica anche il mezzo extracellulare attraverso l'idratazione a bicarbonato.
    1. Substract mitochondrial ha contribuito all'acidificazione media (mitoECAR) da totalECAR per ottenere il glycoECAR.
      figure-protocol-3 (Eq. 3) 28 anni
      NOTA: La respirazione mitocondriale e il ciclo TCA sono processi fortemente accoppiati. La produzione di CO2 dai mitocondri è una funzione del tasso di OXPHOS, che è misurabile da mitoOCR.
    2. Calcola il mitoECAR come:
      figure-protocol-4 (Eq. 4) 28 anni
      dove, il CCF (CO2 Contribution Factor) è un valore di rapporto calcolato empiricamente, che rappresenta la quantità di contributo H+ da acidificazione mediata da CO2 rispetto a ciascun consumo di O2 da OXPHOS. Il CCF per questo sistema è predeterminato a 0,6028. La misurazione accurata dell'acidificazione del mezzo è determinata dalla capacità tampone del mezzo, dalla sensibilità del sensore di pH dello strumento e dall'effettiva capacità della camera di misura. Qui, il BF (Buffer Factor) è un parametro della capacità tampone sperimentale in situ, che rappresenta la quantità di H + o OH- aggiunta alla camera di misurazione efficace per modificare il livello di pH di 1 unità. Quando si utilizza un mezzo di saggio personalizzato, il BF può essere determinato titolando quantità note di acido nel mezzo di analisi seguendo il protocollo Buffer Factor30. Il Seahorse DMEM medium pH 7.4 utilizzato in questo protocollo ha un BF predeterminato di 2.60 mmol H+/L/pH. La piastra di cattura dell'isolotto utilizzata in questo protocollo ha una Volmicrochamber = 16,6 μL31. Il fattore di scala del volume, Kvol, è una costante determinata empiricamente. Il valore di Kvol non è disponibile per la piastra di cattura dell'isolotto, ma può essere calcolato dal valore della micropiastra28, tenendo conto della differenza di volume nelle loro microcamere, a 0,41.
      NOTA: l'iniezione di Rot/AA arresta la respirazione mitocondriale e costringe il tessuto a passare alla glicolisi per la produzione di ATP, portando a una maggiore estrusione di lattato e ad un aumento della misurazione ECAR. La glicolisi viene interrotta con l'iniezione di 2-DG e la misurazione ECAR residua rivela acidificazione non glicolitica e non mitocondriale del mezzo.
    3. Calcola la capacità di riserva glicolitica (GRC) come:
      figure-protocol-5 (Eq. 5) 32 anni
      dove, l'ultima lettura tra le 5 misurazioni prima dell'iniezione di Rot/AA viene presa come valore "basale" (glicoECARbasal). La lettura più alta tra le 4 misurazioni successive all'iniezione di Rot/AA viene utilizzata come valore "max" (glycoECARmax). La lettura più bassa tra le 4 misurazioni successive all'iniezione di 2-DG viene utilizzata come glycoECAR2-DG.
  3. Normalizzazione
    NOTA: La normalizzazione è essenziale quando si confrontano le letture dei tessuti retinici di diverse fasce d'età o tra campioni wild-type e patologici/degenerativi, che potrebbero differire nel numero di cellule.
    1. Utilizzare kit disponibili commercialmente per valutare il contenuto di DNA in ciascun disco di punzonatura retinica33,34.
    2. In alternativa, utilizzare il tampone del saggio di radioimmunoprecipitazione (tampone RIPA) per estrarre la proteina totale dal pugno retinico e utilizzare il contenuto proteico per la normalizzazione.
      NOTA: La superficie di una retina di topo adulto è stata precedentemente determinata intorno ai 20 mm2 e ogni retina contiene circa 6,5 milioni di cellule35. Quindi, ogni punzone retinico di 1 mm di diametro è ~ 1/25 di una singola retina e contiene ~ 260K cellule. Si può fare riferimento a questi numeri quando si confrontano i dati di un pugno retinico con quelli di altri campioni di tessuto o cellule coltivate,

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Risultati

I dati riportati qui sono un test rappresentativo dello stress mitocondriale che mostra tracce OCR (Figura 1) e test della velocità glicolitica che mostra traccia OCR e traccia ECAR (Figura 2), che sono stati eseguiti utilizzando dischi perforati retinici da 1 mm appena sezionati da topi transgenici Nrl-L-EGFP di 4 mesi ( sfondo C57B / L6). Questi topi esprimono GFP specificamente nei fotorecettori a bastoncello senza alterare il...

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Discussione

Di seguito sono fornite istruzioni dettagliate per l'esecuzione di saggi basati su micropiastre della respirazione mitocondriale e dell'attività di glicolisi utilizzando dischi di perforazione retinica ex vivo appena sezionati. Il protocollo è stato ottimizzato per: 1) garantire l'utilizzo di un mezzo di saggio idoneo per il tessuto retinico ex vivo; 2) impiegare dischi di punzonatura retinica di dimensioni adeguate per ottenere letture OCR ed ECAR che rientrano nel campo di rilevamento ottimale della m...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è supportato dal programma di ricerca intramurale del National Eye Institute (ZIAEY000450 e ZIAEY000546).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1X PBSThermo Fisher14190-144
2-Deossiglucosio (2-DG), 500 mM di soluzione madreSigmaD6134Sciogliere in cavalluccio marino XF DMEM medium, preparare in anticipo
ago calibro 30BD Precision Glide305106
Antimicina A, 10 mM di soluzione madreSigmaA8674Sciogliere in DMSO, preparare in anticipo
Bam15, 10 mM stock soluzioneTimTecST056388Dissolvere in DMSO, preparare in anticipo
Perforatore per biopsia, 1 mmIntegra Miltex33-31AA
Cell-TakCorning Life SciencesCB40240
Camera
Pinze per dissezione-Dumont #5Fine Science Tools11251-10con punta dritta
pinze-Dumont #7Fine Science Tools11274-20Microscopio
dissezione
DMSOSigmaD2438
Pinza GraefeFine Science Tools11051-10a punta curva e seghettata
Fine Science Tools15004-08a punta curva
, 1 MSigma-AldrichS8263Soluzione acquosa, preparare in anticipo
Rotenone, 10 mM soluzione madreSigmaR8875Sciogliere in DMSO, preparare in anticipo il mezzo di
calibrazione del cavalluccio marinoAgilent100840-000
Cavalluccio marino XF 1,0 M glucosioAgilent103577-100
Cavalluccio marino XF 100 mM piruvatoAgilent103578-100
Cavalluccio marino XF 200 mM glutamminaAgilent103579-100
Cavalluccio marino XF DMEM medioAgilent103575-100pH 7,4, con 5 mM HEPES
Cavalluccio marino XFe24 Cattura isolotti FluxPakAgilent103518-100Contiene cartuccia sensore e micropiastra per cattura isolotti
Cavalluccio marino XFe24, Analizzatore di flusso cellulare extraAgilent
Soluzione di bicarbonato di sodio, 0,1 MSigma-AldrichS5761Soluzione acquosa, preparare in anticipo
Pennello per ciglia superfineTed Pella113
per asfissia di CO2 Dissezione da a punta curva Microforbici Soluzione NaOH

Riferimenti

  1. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  2. Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye Brain. 2, 99-116 (2010).
  3. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease. Progress in Retina and Eye Research. 20, 175-208 (2001).
  4. Barot, M., Gokulgandhi, M. R., Mitra, A. K. Mitochondrial dysfunction in retinal diseases. Current Eye Research. 36 (12), 1069-1077 (2011).
  5. Joyal, J. S., Gantner, M. L., Smith, L. E. H. Retinal energy demands control vascular supply of the retina in development and disease: The role of neuronal lipid and glucose metabolism. Progress in Retina and Eye Research. 64, 131-156 (2018).
  6. Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of Neuroscience Research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
  7. Haydinger, C. D., Kittipassorn, T., Peet, D. J. Power to see-Drivers of aerobic glycolysis in the mammalian retina: A review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1057-1071 (2020).
  8. Wright, A. F., et al. Lifespan and mitochondrial control of neurodegeneration. Nature Genetics. 36, 1153-1158 (2004).
  9. Bossy-Wetzel, E., Schwarzenbacher, R., Lipton, S. A. Molecular pathways to neurodegeneration. Nature Medicine. 10, Suppl 2-9 (2004).
  10. Leveillard, T., Philp, N. J., Sennlaub, F. Is retinal metabolic dysfunction at the center of the pathogenesis of age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), (2019).
  11. Vlachantoni, D., et al. Evidence of severe mitochondrial oxidative stress and a protective effect of low oxygen in mouse models of inherited photoreceptor degeneration. Human Molecular Genetics. 20 (2), 322-335 (2011).
  12. Grenell, A., et al. Loss of MPC1 reprograms retinal metabolism to impair visual function. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (9), 3530-3535 (2019).
  13. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews in Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).
  14. Jarrett, S. G., Boulton, M. E. Consequences of oxidative stress in age-related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 399-417 (2012).
  15. Rozing, M., et al. Age-related macular degeneration: A two-level model hypothesis. Progress in Retina Eye Research. 76, 100825(2020).
  16. Yokosako, K., et al. Glycolysis in patients with age-related macular degeneration. Open Ophthalmology Journal. 8, 39-47 (2014).
  17. Bek, T. Mitochondrial dysfunction and diabetic retinopathy. Mitochondrion. 36, 4-6 (2017).
  18. Yumnamcha, T., Guerra, M., Singh, L. P., Ibrahim, A. S. Metabolic dysregulation and neurovascular dysfunction in diabetic retinopathy. Antioxidants. 9 (12), Basel. (2020).
  19. Futterman, S., Kinoshita, J. H. Metabolism of the retina. I. Respiration of cattle retina. Journal of Biological Chemistry. 234 (4), 723-726 (1959).
  20. Linsenmeier, R. A. Effects of light and darkness on oxygen distribution and consumption in the cat retina. Journal of General Physiology. 88 (4), 521-542 (1986).
  21. Medrano, C. J., Fox, D. A. Oxygen consumption in the rat outer and inner retina: light- and pharmacologically-induced inhibition. Experiments in Eye Research. 61 (3), 273-284 (1995).
  22. Kooragayala, K. Quantification of oxygen consumption in retina ex vivo demonstrates limited reserve capacity of photoreceptor mitochondria. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
  23. Adlakha, Y. K., Swaroop, A. Determination of mitochondrial oxygen consumption in the retina ex vivo: applications for retinal disease. Methods in Molecular Biology. 1753, 167-177 (2018).
  24. Agilent Mitocondrial stress test user guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021).
  25. Agilent Glycolytic rate assay user guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf (2021).
  26. Agilent wave 2.6 user guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/S7894-10000_Rev_C_Wave_2_6_User_Guide.pdf (2021).
  27. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , Available from: https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf (2021).
  28. Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf (2021).
  29. Report Generator User Guide Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf (2021).
  30. Agilent Seahorse XF Buffer Factor Protocol. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf (2021).
  31. Agilent sensor cartridges and cell culture microplates. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf (2021).
  32. Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021).
  33. Fan, Y. Y. A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309, 1-9 (2015).
  34. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  35. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  36. Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (10), 3890-3895 (2006).
  37. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).
  38. Corso-Diaz, X., et al. Genome-wide profiling identifies DNA methylation signatures of aging in rod photoreceptors associated with alterations in energy metabolism. Cell Reports. 31 (3), 107525(2020).
  39. Berkowitz, B. A., et al. Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).
  40. Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).

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