6-hydroxydopaminråttmodellen för Parkinsons sjukdom
Summary
6-hydroxydopamin (6-OHDA) modellen har använts i årtionden för att främja förståelsen av Parkinsons sjukdom. I detta protokoll visar vi hur man utför ensidiga nigrostriatala lesioner hos råttan genom att injicera 6-OHDA i det mediala framhjärnbuntet, bedöma motoriska underskott och förutsäga lesioner med hjälp av stegtestet.
Abstract
Motoriska symtom på Parkinsons sjukdom (PD) – bradykinesi, akinesi och tremor i vila – är konsekvenser av neurodegenerationen av dopaminerga neuroner i substantia nigra pars compacta (SNc) och dopaminergt striatalt underskott. Djurmodeller har använts i stor utsträckning för att simulera mänsklig patologi i laboratoriet. Gnagare är de mest använda djurmodellerna för PD på grund av deras enkla hantering och underhåll. Dessutom är anatomin och molekylära, cellulära och farmakologiska mekanismerna för PD likartade hos gnagare och människor. Infusionen av neurotoxinet, 6-hydroxydopamin (6-OHDA), i en medial förhjärnbunt (MFB) av råttor reproducerar den allvarliga förstörelsen av dopaminerga neuroner och simulerar PD-symtom. Detta protokoll visar hur man utför den ensidiga mikroinjektionen av 6-OHDA i MFB i en råttmodell av PD och visar de motoriska underskotten som induceras av 6-OHDA och förutsagda dopaminerga lesioner genom stegtestet. 6-OHDA orsakar signifikant försämring av antalet steg som utförs med den kontralaterala frambenet.
Introduction
De viktigaste neuropatologiska egenskaperna hos PD är den kroniska progressiva neurodegenerationen av dopaminerga nervceller i substantia nigra pars compacta (SNc) och närvaron av Lewy-kroppar innehållande α-synukleinprotein1. Eftersom SNc dopaminerga neuroner projicerar sina axoner i striatum genom nigrostriatalvägen, resulterar neurodegeneration av neuroner i SNc i ett dopaminergt underskott i striatum2. Frånvaron av dopamin i striatum orsakar en obalans i aktiviteterna hos de direkta och indirekta motoriska kontrollvägarna, vilket är ansvarigt för de viktigaste motoriska symptomen på PD: akinesi (långsam rörelse), bradykinesi (svårigheter att starta rörelser), muskelstyvhet och tremor i vila3,4,5.
Eftersom de molekylära och fysiologiska mekanismer som är involverade i uppkomsten av PD fortfarande inte är helt förstådda, syftar för närvarande tillgängliga huvudbehandlingar till att lindra de motoriska symtomen genom farmakoterapier, djup hjärnstimulering6,7, genetiska terapier8 och celltransplantation9. Därför är preklinisk forskning grundläggande för att belysa mekanismerna som är involverade i uppkomsten av PD och upptäcka nya metoder för tidig diagnos och nya terapier för att förhindra eller stoppa degenerering av neuroner som påverkas av PD10.
Djurmodeller har använts i stor utsträckning för att simulera mänsklig patologi i laboratoriet, vilket bidrar till utvecklingen av medicin och vetenskap11,12,13,14. Det är dock viktigt att betona att det korrekta valet av djurmodellen är grundläggande för studiens framgång. Därför måste djurmodellen valideras i tre huvudaspekter: i) ansiktsgiltighet, där djurmodellen måste ha egenskaperna hos mänsklig patologi; ii) konstruktiv validitet, där djurmodellen måste ha en solid teoretisk grund; och iii) prediktiv validitet, där djurmodeller måste reagera på behandlingar på ett liknande sätt som klinisk behandling.
För närvarande används flera djur som djurmodeller för PD. Huvudgrupperna inkluderar däggdjur, såsom gnagare, primater, minipigs, hundar och katter och andra grupper som drosophila och zebrafisk. Gnagare är den mest klassiska djurmodellen för PD och den mest använda på grund av deras enkla hantering och underhåll. Dessutom är anatomin och molekylära, cellulära och farmakologiska mekanismerna för PD likartade hos gnagare och människor15.
En översyn publicerad av Kin och kollegor 2019 analyserade de viktigaste djurmodellmetoderna som användes för PD på 2000-talet och fann att den mest använda djurmodellen involverade neurotoxiner som 6-hydroxidopamin (6-OHDA) och 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP). Båda neurotoxinerna orsakar mitokondriell dysregulering i dopaminerga nervceller i nigrostriatalvägen, vilket leder till celldöd16. En annan allmänt använd modell involverar genetisk manipulation genom mutation i specifika gener som är involverade i uppkomsten av PD, vilket orsakar mitokondriell dysregulering17. Neurotoxinmodeller används ofta för att utvärdera och jämföra terapier, medan genetiska modeller används för att studera utvecklingen av förebyggande terapier och idiopatisk PD15.
Neurotoxinet MPTP upptäcktes orsaka parkinsonism i mitten av 1980-talet efter att sju patienter använt ämnet och uppvisat allvarliga PD-symtom. Förutom symtomen svarade patienterna på behandling med L-DOPA, vilket gjorde att forskarna kopplade molekylen direkt till PD. Efter att fallet publicerades 1986 började flera forskare använda MPTP i preklinisk PD-forskning18. Forskare har funnit att MPTP är en lipofil molekyl och kan korsa blod-hjärnbarriären (BBB) och omvandlas till MPP + 19. Denna giftiga substans ackumuleras inuti neuroner och orsakar skador på komplex 1 i mitokondriell andningskedja, vilket leder till att dopaminerga neuronerdöddöd20.
6-OHDA-neurotoxinmodellen användes först för att inducera degenerering av monoaminneuroner i nigrostriatalvägen 196821. 6-OHDA-modellen används ofta för att orsaka neurodegeneration i nigrostriatalvägen eftersom det är en dopaminanalog och giftig för katekolamininnehållande celler. Efter att 6-OHDA har trängt in i hjärnan kan det tas upp av dopamintransportören (DAT) i dopaminerga nervceller, vilket leder till degenerering av nigrostriatalvägen22. Eftersom 6-OHDA inte tränger in i BBB måste det administreras direkt genom intrarebrala stereotaxiska injektioner23. En noradrenalinåterupptagshämmare kombineras ofta med 6-OHDA-mikroinjektion för att bevara noradrenerga fibrer och ge en mer selektiv degenerering av dopaminerga nervceller24.
Efter att DAT har upptjämnat 6-OHDA kommer det att ackumuleras i cytosolen hos neuroner, vilket producerar reaktiva syrearter (ROS) och leder till celldöd15. Tre olika lesionsmodeller av 6-OHDA används ofta: i) lesioner till SNc25,26; ii) lesioner på striatum27,28; iii) lesioner på MFB29,30. Lesioner orsakade i striatum resulterar i en långsam och retrograd degeneration av dopaminerga neuroner i SNpc. Däremot resulterar lesioner orsakade i SNpc och MFB i snabb och total degenerering av nervceller, vilket leder till mer avancerade parkinsoniska symtom31.
Ensidig eller bilateral injektion av 6-OHDA kan orsaka neurodegeneration i dopaminerga nervceller. 6-OHDA orsakar inte alltid allvarliga skador på neuronerna; Ibland resulterar injektionen i partiell skada, som också används för att simulera de tidiga stadierna av PD32. Den ensidiga injektionen används oftare på grund av modellens förmåga att bedöma djurets motoriska underskott och förutsäga cellförlust genom tester som amfetamin/apomorfininducerad rotation och stegtestet29. Bilaterala injektioner används mest för att utvärdera rumsligt minne och igenkänning33.
Amfetamin / apomorfininducerad rotationstest är ett beteendetest som vanligtvis används för att förutsäga cellförlust i nigrostriatalvägen. Det definieras som en process där upprepad administrering av dopaminagonister leder till en intensifiering av rotationsbeteendet hos 6-OHDA-lesionerade djur34. Rotationsbeteende består av kvantifiering av amfetamininducerad ipsilateral rotation eller apomorfininducerade kontralaterala varv hos ensidigt lesionerade gnagare. Läkemedelsinducerat rotationsbeteende har kritiserats eftersom rotation inte motsvarar PD-symtom hos människor och kan påverkas av variabler som tolerans, sensibilisering och “priming”35.
Priming är en av de mest kritiska faktorerna i dessa beteendetester. Vissa fall har rapporterats där en engångsdos av L-DOPA ledde till ett misslyckande i rotationsbeteenden36. Dessutom är en annan kritisk faktor relaterad till den kombinerade tillämpningen av det amfetamininducerade testet och apomorfininducerat test för parallell användning att de mäter olika effektmått på grund av olika verkningsmekanismer, vilket återspeglar inaktiveringen av olika signalmekanismer och vägar. Vidare är det amfetamininducerade testet mer exakt för att mäta nigrostriatala lesioner över 50-60%, medan det apomorfininducerade testet är mer exakt för lesioner över 80%37.
Stegtestet har framkommit som ett beteendetest som indikerar underskott relaterade till dopaminerg neurondegenerering och terapeutiska effekter. Det möjliggör analys av akinesi orsakad av en 6-OHDA-lesion i dopaminerga neuroner utan ett läkemedelsinducerat förfarande. Dessutom har testet varit väl etablerat och vanligt förekommande sedan 1995, då det först beskrevs av Olsson et al.35. År 1999 analyserade chang et al.38 också råttornas prestanda i stegtestet med nivån av degeneration orsakad av 6-OHDA och fann att djur som presterade sämre i stegtestet också hade en mer signifikant degenerering av dopaminerga neuroner.
Stegtestet är en utmärkt metod för att förutsäga allvarlig dopaminerg nigrostriatal skada hos 6-OHDA-lesionerade råttor. Bevis tyder på att motoriska underskott uppträder i den kontralaterala frambenet av 6-OHDA-infusionen under stegtestet när graden av dopaminerg förlust i SNc är >90%39. Detta dokument beskriver protokoll, metoder och material som används för att utföra stereotaxisk kirurgi för ensidig infusion av 6-OHDA i MFB hos råttor och hur man förutsäger de dopaminerga lesionerna som orsakas av toxinet genom stegtestet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta dokument beskriver ett protokoll för att utföra kirurgi för ensidig mikroinfusion av 6-OHDA i MFB, som kan orsaka robusta lesioner i neuronerna i nigrostriatalvägen och generera akinesi i djuret. Också beskrivet är protokollet för att utföra stegtestet, ett lätt tillämpligt och icke-invasivt test som kan användas för att bevisa framgången för lesionerna och bedöma förben akinesi. Som presenteras i de representativa resultaten visade djur som fick 6-OHDA en minskning av antalet justeringssteg kontral…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av São Paulo Research Foundation (FAPESP, bidrag 2017/00003-0). Vi är tacksamma för samordningen för förbättring av personal inom högre utbildning (CAPES). Vi tackar Dr. Anthony R. West, Dr. Heinz Steiner och Dr. Kuei Y. Tseng för stöd och mentorskap.
Materials
| 6-OHDA | Sigma Aldrich | H4381 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt®ion=BR&cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel _6-ohda-_-srpRecs3-1 |
| 70% Alcohol | |||
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | 795437 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt®ion=BR&gclid= Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09 _kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO 6yicaAot6EALw_wcB |
| Cotton | |||
| Drill or tap | |||
| Gauze | |||
| Hamilton syringe 50 uL | Hamilton | 80539 | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539 |
| Imipramine | Alfa Aeser | J63723 | https://www.alfa.com/pt/catalog/J63723/ |
| Infusion pump | Insight | EFF-311 | https://insightltda.com.br/produto/eff-311-bomba-de-infusao-2-seringas/ |
| Ketamine (Dopalen) | Ceva | https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/DOPALEN | |
| Machine for trichotomy | |||
| Meloxicam (Maxicam 2% Ourofino) | Ourofino | https://terrazoo.com.br/produto/maxicam-injetavel-2-50ml-ouro-fino/ | |
| Metal Disposal | |||
| Paper towels | |||
| Pentabiotic | Zoetis | https://www.zoetis.com.br/pentabiotico-veterinario.aspx | |
| Plastic waste garbage can | |||
| Poly-antibiotic | Pentabiotic (Wealth) | ||
| Povidone-iodine | |||
| Scalpel and blades | |||
| Scissors | |||
| Scraper | |||
| Stereotaxic apparatus | Insight | EFF-331 | https://insightltda.com.br/produto/eff-331-estereotaxico-1-torre/ |
| Sterile saline solution | |||
| Swabs | |||
| Temperature probe | |||
| Timer | |||
| Tweezers | |||
| Xylazine (Anasedan) | Ceva | https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN |
Riferimenti
- Gibb, W. R., Lees, A. J. The relevance of the Lewy body to the pathogenesis of idiopathic Parkinson’s disease. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 51 (6), 745-752 (1988).
- Albin, R. L., Young, A. B., Penney, J. B. The functional anatomy of basal ganglia disorders. Trends in Neurosciences. 12 (10), 366-375 (1989).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology & Medicine. 62, 132-144 (2013).
- Obeso, J. A., et al. Functional organization of the basal ganglia: therapeutic implications for Parkinson’s disease. Movement Disorders. 23, 548-559 (2008).
- Tysnes, O. -. B., Storstein, A. Epidemiology of Parkinson’s disease. Journal of Neural Transmission. 124 (8), 901-905 (2017).
- Karachi, C., et al. Clinical and anatomical predictors for freezing of gait and falls after subthalamic deep brain stimulation in Parkinson’s disease patients. Parkinsonism & Related Disorders. 62, 91-97 (2019).
- Sudhakar, V., Richardson, R. M. Gene therapy for Parkinson’s disease. Progress in Neurological Surgery. 33, 253-264 (2018).
- Baizabal-Carvallo, J. F., et al. Combined pallidal and subthalamic nucleus deep brain stimulation in secondary dystonia-parkinsonism. Parkinsonism & Related Disorders. 19 (5), 566-568 (2013).
- Morizane, A. Cell therapy for Parkinson’s disease with induced pluripotent stem cells. Clinical Neurology. 59 (3), 119-124 (2019).
- Jankovic, J., Tan, E. K. Parkinson’s disease: etiopathogenesis and treatment. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 91 (8), 795-808 (2020).
- Cenci, M. A., Whishaw, I. Q., Schallert, T. Animal models of neurological deficits: how relevant is the rat. Nature Reviws. Neuroscience. 3 (7), 574-579 (2002).
- Tronci, E., Francardo, V. Animal models of l-DOPA-induced dyskinesia: the 6-OHDA-lesioned rat and mouse. Journal of Neural Transmission. 125 (8), 1137-1144 (2018).
- Lane, E., Dunnett, S. Animal models of Parkinson’s disease and L-dopa induced dyskinesia: How close are we to the clinic. Psychopharmacology. 199 (3), 303-312 (2008).
- Meredith, G. E., Sonsalla, P. K., Chesselet, M. -. F. Animal models of Parkinson’s disease progression. Acta Neuropathologica. 115 (4), 385-398 (2008).
- Kin, K., Yasuhara, T., Kameda, M., Date, I. Animal models for Parkinson’s disease research: trends in the 2000s. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5402 (2019).
- Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson’s disease: 6-OHDA and MPTP. Cell and Tissue Research. 318 (1), 215-224 (2004).
- Smith, G. A., Isacson, O., Dunnett, S. B. The search for genetic mouse models of prodromal Parkinson’s disease. Experimental Neurology. 237 (2), 267-273 (2012).
- Langston, J. W., Ballard, P., Tetrud, J. W., Irwin, I. Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science. 219 (4587), 979-980 (1983).
- Langston, J. W., Irwin, I., Langston, E. B., Forno, L. S. 1-Methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP+): identification of a metabolite of MPTP, a toxin selective to the substantia nigra. Neuroscience Letters. 48 (1), 87-92 (1984).
- Ramsay, R. R., Salach, J. I., Singer, T. P. Uptake of the neurotoxin 1-methyl-4-phenylpyridine (MPP+) by mitochondria and its relation to the inhibition of the mitochondrial oxidation of NAD+-linked substrates by MPP+. Biochemical and Biophysical Research Communications. 134 (2), 743-748 (1986).
- Ungerstedt, U. 6-Hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons. European Journal of Pharmacology. 5 (1), 107-110 (1968).
- Blandini, F., Armentero, M. -. T. Animal models of Parkinson’s disease. FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).
- McDowell, K., Chesselet, M. -. F. Animal models of the non-motor features of Parkinson’s disease. Neurobiology of Disease. 46 (3), 597-606 (2012).
- Luthman, J., Fredriksson, A., Sundström, E., Jonsson, G., Archer, T. Selective lesion of central dopamine or noradrenaline neuron systems in the neonatal rat: motor behavior and monoamine alterations at adult stage. Behavioural Brain Research. 33 (3), 267-277 (1989).
- Casarrubea, M., et al. Effects of Substantia Nigra pars compacta lesion on the behavioral sequencing in the 6-OHDA model of Parkinson’s disease. Behavioural Brain Research. 362, 28-35 (2019).
- Wang, R., Shao, M. L-DOPA-elicited abnormal involuntary movements in the rats damaged severely in substantia nigra by 6-hydroxydopamine. Annals of Palliative Medicine. 9 (3), 947-956 (2020).
- Hernandez-Baltazar, D., Mendoza-Garrido, M. E., Martinez-Fong, D. Activation of GSK-3β and caspase-3 occurs in Nigral dopamine neurons during the development of apoptosis activated by a striatal injection of 6-hydroxydopamine. PLoS One. 8 (8), 70951 (2013).
- Bagga, V., Dunnett, S. B., Fricker, R. A. The 6-OHDA mouse model of Parkinson’s disease – Terminal striatal lesions provide a superior measure of neuronal loss and replacement than median forebrain bundle lesions. Behavioural Brain Research. 288, 107-117 (2015).
- Iancu, R., Mohapel, P., Brundin, P., Paul, G. Behavioral characterization of a unilateral 6-OHDA-lesion model of Parkinson’s disease in mice. Behavioural Brain Research. 162 (1), 1-10 (2005).
- Boix, J., Padel, T., Paul, G. A partial lesion model of Parkinson’s disease in mice – Characterization of a 6-OHDA-induced medial forebrain bundle lesion. Behavioural Brain Research. 284, 196-206 (2015).
- Blesa, J., Phani, S., Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Classic and new animal models of Parkinson’s disease. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012, 845618 (2012).
- Breit, S., et al. Effects of 6-hydroxydopamine-induced severe or partial lesion of the nigrostriatal pathway on the neuronal activity of pallido-subthalamic network in the rat. Experimental Neurology. 205 (1), 36-47 (2007).
- More, S. V., Kumar, H., Cho, D. -. Y., Yun, Y. -. S., Choi, D. -. K. Toxin-induced experimental models of learning and memory impairment. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1447 (2016).
- Schwarting, R. K. W., Huston, J. P. The unilateral 6-hydroxydopamine lesion model in behavioral brain research. Analysis of functional deficits, recovery and treatments. Progress in Neurobiology. 50 (2-3), 275-331 (1996).
- Olsson, M., Nikkhah, G., Bentlage, C., Björklund, A. Forelimb akinesia in the rat Parkinson model: differential effects of dopamine agonists and nigral transplants as assessed by a new stepping test. Journal of Neuroscience. 15 (5), 3863-3875 (1995).
- Lindgren, H. S., Rylander, D., Ohlin, K. E., Lundblad, M., Cenci, M. A. The ‘motor complication syndrome’ in rats with 6-OHDA lesions treated chronically with l-DOPA: Relation to dose and route of administration. Behavioural Brain Research. 177 (1), 150-159 (2007).
- Björklund, A., Dunnett, S. B. The amphetamine induced rotation test: A re-assessment of its use as a tool to monitor motor impairment and functional recovery in rodent models of Parkinson’s disease. Journal of Parkinson’s Disease. 9 (1), 17-29 (2019).
- Chang, J. W., Wachtel, S. R., Young, D., Kang, U. J. Biochemical and anatomical characterization of forepaw adjusting steps in rat models of Parkinson’s disease: studies on medial forebrain bundle and striatal lesions. Neuroscienze. 88 (2), 617-628 (1999).
- Jayasinghe, V. R., Flores-Barrera, E., West, A. R., Tseng, K. Y. Frequency-dependent corticostriatal disinhibition resulting from chronic dopamine depletion: role of local striatal cGMP and GABA-AR signaling. Cerebral Cortex. 27 (1), 625-634 (2017).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2006).
- Padovan-Neto, F. E., et al. Selective regulation of 5-HT1B serotonin receptor expression in the striatum by dopamine depletion and repeated L-DOPA treatment: relationship to L-DOPA-induced dyskinesias. Molecular Neurobiology. 57 (2), 736-751 (2020).
- Prasad, E. M., Hung, S. -. Y. Behavioral tests in neurotoxin-induced aAnimal models of Parkinson’s disease. Antioxidants. 9 (10), 1007 (2020).
- Lundblad, M., Picconi, B., Lindgren, H., Cenci, M. A. A model of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned mice: Relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiology of Disease. 16 (1), 110-123 (2004).
- Masini, D., et al. A guide to the generation of a 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson’s disease for the study of non-motor symptoms. Biomedicines. 9 (6), 598 (2021).
- Francardo, V., et al. Impact of the lesion procedure on the profiles of motor impairment and molecular responsiveness to L-DOPA in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson’s disease. Neurobiology of Disease. 42 (3), 327-340 (2011).
- Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J. E. Development of a unilaterally-lesioned 6-OHDA mouse model of Parkinson’s disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3234 (2012).
- Fish, R., Danneman, P., Brown, M., Karas, A. . Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (2008).
- Buitrago, S., Martin, T. E., Tetens-Woodring, J., Belicha-Villanueva, A., Wilding, G. E. Safety and efficacy of various combinations of injectable anesthetics in BALB/c mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Sciences. 47 (1), 11-17 (2008).
- Struck, M. B., Andrutis, K. A., Ramirez, H. E., Battles, A. H. Effect of a short-term fast on ketamine-xylazine anesthesia in rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Sciences. 50 (3), 344-348 (2011).
- Jiron, J. M., et al. Comparison of isoflurane, ketamine-dexmedetomidine, and ketamine-xylazine for general anesthesia during oral procedures in rice rats (Oryzomys palustris). Journal of the American Association for Laboratory Animal Sciences. 58 (1), 40-49 (2019).
