Das 6-Hydroxydopamin-Rattenmodell der Parkinson-Krankheit
Summary
Das 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) -Modell wird seit Jahrzehnten verwendet, um das Verständnis der Parkinson-Krankheit voranzutreiben. In diesem Protokoll zeigen wir, wie man einseitige nigrostriatale Läsionen bei der Ratte durchführt, indem man 6-OHDA in das mediale Vorderhirnbündel injiziert, motorische Defizite beurteilt und Läsionen mit dem Schritttest vorhersagt.
Abstract
Motorische Symptome der Parkinson-Krankheit (PD) – Bradykinesie, Akinesie und Ruhetremor – sind Folgen der Neurodegeneration dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra pars compacta (SNc) und des dopaminergen striatalen Defizits. Tiermodelle wurden häufig verwendet, um die menschliche Pathologie im Labor zu simulieren. Nagetiere sind aufgrund ihrer einfachen Handhabung und Wartung die am häufigsten verwendeten Tiermodelle für PD. Darüber hinaus sind die Anatomie und die molekularen, zellulären und pharmakologischen Mechanismen von PD bei Nagetieren und Menschen ähnlich. Die Infusion des Neurotoxins 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) in ein mediales Vorderhirnbündel (MFB) von Ratten reproduziert die schwere Zerstörung dopaminerger Neuronen und simuliert PD-Symptome. Dieses Protokoll zeigt, wie die einseitige Mikroinjektion von 6-OHDA im MFB in einem Rattenmodell von PD durchgeführt werden kann, und zeigt die durch 6-OHDA induzierten motorischen Defizite und vorhergesagte dopaminerge Läsionen durch den Schritttest. Das 6-OHDA verursacht eine erhebliche Beeinträchtigung der Anzahl der Schritte, die mit dem kontralateralen Vordermaß durchgeführt werden.
Introduction
Die wichtigsten neuropathologischen Merkmale von PD sind die chronisch fortschreitende Neurodegeneration dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra pars compacta (SNc) und das Vorhandensein von Lewy-Körpern, die α-Synuclein-Protein enthalten1. Da die dopaminergen SNc-Neuronen ihre Axone über den nigrostriatalen Weg in das Striatum projizieren, führt die Neurodegeneration von Neuronen in SNc zu einem dopaminergen Defizit im Striatum2. Das Fehlen von Dopamin im Striatum verursacht ein Ungleichgewicht in den Aktivitäten der direkten und indirekten motorischen Kontrollwege, das für die wichtigsten motorischen Symptome von PD verantwortlich ist: Akinesie (langsame Bewegung), Bradykinesie (Schwierigkeiten beim Starten von Bewegungen), Muskelsteifheit und Zittern in Ruhe3,4,5.
Da die molekularen und physiologischen Mechanismen, die am Ausbruch der Parkinson-Krankheit beteiligt sind, noch nicht vollständig verstanden sind, versuchen die derzeit verfügbaren Hauptbehandlungen, die motorischen Symptome durch Pharmakotherapien, Tiefe Hirnstimulation6,7, genetische Therapien8 und Zelltransplantationen zu lindern9. Daher ist die präklinische Forschung von grundlegender Bedeutung, um die Mechanismen aufzuklären, die am Ausbruch von Parkinson beteiligt sind, und neue Methoden für die Früherkennung und neue Therapien zu entdecken, um die Degeneration von Neuronen, die von PD10 betroffen sind, zu verhindern oder zu stoppen.
Tiermodelle wurden häufig verwendet, um die menschliche Pathologie im Labor zu simulieren und zum Fortschritt von Medizin und Wissenschaft beizutragen11,12,13,14. Es ist jedoch wichtig zu betonen, dass die richtige Wahl des Tiermodells für den Erfolg der Studie von grundlegender Bedeutung ist. Daher muss das Tiermodell in drei Hauptaspekten validiert werden: i) Gesichtsvalidität, bei der das Tiermodell die Merkmale der menschlichen Pathologie aufweisen muss; ii) konstruktive Validität, bei der das Tiermodell eine solide theoretische Grundlage haben muss; und iii) prädiktive Validität, bei der Tiermodelle auf Behandlungen in ähnlicher Weise wie klinische Behandlungen ansprechen müssen.
Derzeit werden mehrere Tiere als Tiermodelle für PD verwendet. Zu den Hauptgruppen gehören Säugetiere wie Nagetiere, Primaten, Minischweine, Hunde und Katzen sowie andere Gruppen wie Drosophila und Zebrafische. Nagetiere sind das klassischste Tiermodell für PD und aufgrund ihrer einfachen Handhabung und Wartung das am häufigsten verwendete. Darüber hinaus sind die Anatomie und die molekularen, zellulären und pharmakologischen Mechanismen von PD bei Nagetieren und Menschen ähnlich15.
Ein von Kin und Kollegen im Jahr 2019 veröffentlichter Review analysierte die wichtigsten Tiermodellmethoden, die in den 2000er Jahren für PD verwendet wurden, und stellte fest, dass das am häufigsten verwendete Tiermodell Neurotoxine wie 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) und 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) umfasste. Beide Neurotoxine verursachen mitochondriale Dysregulation in dopaminergen Neuronen im nigrostriatalen Signalweg, was zum Zelltod führt16. Ein weiteres weit verbreitetes Modell beinhaltet die genetische Manipulation durch Mutation in bestimmten Genen, die am Ausbruch von PD beteiligt sind und eine mitochondriale Dysregulation verursachen17. Neurotoxinmodelle werden häufig verwendet, um Therapeutika zu bewerten und zu vergleichen, während genetische Modelle verwendet werden, um die Entwicklung von präventiven Therapien und idiopathischen PD15 zu untersuchen.
Das Neurotoxin MPTP wurde Mitte der 1980er Jahre entdeckt, um Parkinsonismus zu verursachen, nachdem sieben Patienten die Substanz verwendet hatten und schwere PD-Symptome zeigten. Zusätzlich zu den Symptomen sprachen die Patienten auf die Behandlung mit L-DOPA an, wodurch die Forscher das Molekül direkt mit PD in Verbindung brachten. Nachdem der Fall 1986 veröffentlicht worden war, begannen mehrere Forscher, MPTP in der präklinischen PD-Forschung einzusetzen18. Forscher haben herausgefunden, dass MPTP als lipophiles Molekül die Blut-Hirn-Schranke (BHS) überwinden und in MPP + 19 umgewandelt werden kann. Diese toxische Substanz sammelt sich in Neuronen an und verursacht Schäden an Komplex 1 der mitochondrialen Atmungskette, was zum Tod dopaminerger Neuronen führt20.
Das 6-OHDA-Neurotoxinmodell wurde erstmals 196821 verwendet, um die Degeneration von Monoaminneuronen des nigrostriatalen Weges zu induzieren. Das 6-OHDA-Modell wird häufig verwendet, um Neurodegeneration im nigrostriatalen Weg zu verursachen, da es ein Dopaminanalogon ist und für katecholaminhaltige Zellen toxisch ist. Nachdem 6-OHDA in das Gehirn gelangt ist, kann es vom Dopamintransporter (DAT) in dopaminergen Neuronen aufgenommen werden, was zu einer Degeneration des nigrostriatalen Weges führt22. Da 6-OHDA nicht in die BHS eindringt, muss es direkt durch intrazerebrale stereotaktische Injektion verabreicht werden23. Ein Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer wird häufig mit einer 6-OHDA-Mikroinjektion kombiniert, um noradrenerge Fasern zu erhalten und eine selektivere Degeneration dopaminerger Neuronen zu erreichen24.
Nachdem DAT 6-OHDA aufgenommen hat, reichert es sich im Zytosol von Neuronen an, produziert reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und führt zum Zelltod15. Drei verschiedene Läsionsmodelle von 6-OHDA werden häufig verwendet: i) Läsionen zum SNc25,26; ii) Läsionen zum Striatum27,28; iii) Läsionen zum MFB29,30. Läsionen, die im Striatum verursacht werden, führen zu einer langsamen und retrograden Degeneration von dopaminergen Neuronen in SNpc. Im Gegensatz dazu führen Läsionen, die in SNpc und MFB verursacht werden, zu einer schnellen und vollständigen Degeneration von Neuronen, was zu fortgeschritteneren Parkinson-Symptomen führt31.
Die einseitige oder bilaterale Injektion von 6-OHDA kann eine Neurodegeneration in dopaminergen Neuronen verursachen. 6-OHDA verursacht nicht immer schwere Schäden an den Neuronen; Manchmal führt die Injektion zu Teilschäden, die auch zur Simulation der frühen Stadien von PD32 verwendet werden. Die einseitige Injektion wird häufiger verwendet, da das Modell in der Lage ist, die motorischen Defizite des Tieres zu beurteilen und den Zellverlust durch Tests wie die amphetamin/apomorphin-induzierte Rotation und den Schritttest29 vorherzusagen. Bilaterale Injektionen werden am häufigsten zur Bewertung des räumlichen Gedächtnisses und der Erkennung verwendet33.
Der Amphetamin / Apomorphin-induzierte Rotationstest ist ein Verhaltenstest, der häufig verwendet wird, um den Zellverlust im nigrostriatalen Weg vorherzusagen. Es ist definiert als ein Prozess, bei dem die wiederholte Verabreichung von Dopaminagonisten zu einer Intensivierung des Rotationsverhaltens bei 6-OHDA-läsionierten Tieren führt34. Das Rotationsverhalten besteht aus der Quantifizierung der amphetamin-induzierten ipsilateralen Rotation oder der apomorphin-induzierten kontralateralen Wendungen bei einseitig läsionierten Nagetieren. Das medikamenteninduzierte Rotationsverhalten wurde kritisiert, da die Rotation nicht den PD-Symptomen beim Menschen entspricht und durch Variablen wie Toleranz, Sensibilisierung und “Priming” beeinflusst werden kann35.
Priming ist einer der kritischsten Faktoren in diesen Verhaltenstests. Es wurden einige Fälle berichtet, in denen eine Einzeldosis L-DOPA zu einem Versagen des Rotationsverhaltens führte36. Darüber hinaus ist ein weiterer kritischer Faktor im Zusammenhang mit der kombinierten Anwendung des Amphetamin-induzierten Tests und des apomorphin-induzierten Tests für den parallelen Gebrauch, dass sie aufgrund unterschiedlicher Wirkmechanismen unterschiedliche Endpunkte messen, was die Inaktivierung verschiedener Signalmechanismen und Signalwege widerspiegelt. Darüber hinaus ist der Amphetamin-induzierte Test genauer, um nigrostriatale Läsionen über 50-60% zu messen, während der apomorphin-induzierte Test für Läsionen über 80% genauer ist37.
Der Schritttest hat sich als Verhaltenstest herausgestellt, der auf Defizite im Zusammenhang mit dopaminerger Neuronendegeneration und therapeutischen Wirkungen hinweist. Es ermöglicht die Analyse von Akinesie, die durch eine 6-OHDA-Läsion in dopaminergen Neuronen verursacht wird, ohne ein medikamenteninduziertes Verfahren. Darüber hinaus ist der Test seit 1995 gut etabliert und wird häufig verwendet, als er erstmals von Olsson et al.35 beschrieben wurde. Im Jahr 1999 analysierten und verglichen Chang et al.38 auch die Leistung von Ratten im Schritttest mit dem Grad der Degeneration, der durch 6-OHDA verursacht wurde, und fanden heraus, dass Tiere, die im Schritttest schlechter abschnitten, auch eine signifikantere Degeneration von dopaminergen Neuronen aufwiesen.
Der Schritttest ist eine ausgezeichnete Methode, um schwere dopaminerge nigrostriatale Schäden bei 6-OHDA-läsionierten Ratten vorherzusagen. Es gibt Hinweise darauf, dass motorische Defizite im kontralateralen Vorderglied der 6-OHDA-Infusion während des Schritttests auftreten, wenn der Grad des dopaminergen Verlusts in SNc >90% beträgt39. Dieses Papier beschreibt die Protokolle, Methoden und Materialien, die zur Durchführung einer stereotaktischen Operation für die einseitige Infusion von 6-OHDA in den MFB von Ratten verwendet werden, und wie die durch das Toxin verursachten dopaminergen Läsionen durch den Schritttest vorhergesagt werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Papier beschreibt ein Protokoll zur Durchführung einer Operation zur einseitigen Mikroinfusion von 6-OHDA im MFB, das in der Lage ist, robuste Läsionen in den Neuronen des nigrostriatalen Weges zu verursachen und Akinesie beim Tier zu erzeugen. Ebenfalls beschrieben wird das Protokoll für die Durchführung des Schritttests, ein leicht anwendbarer und nichtinvasiver Test, mit dem der Erfolg der Läsionen nachgewiesen und die Akinesie der Vordergliedmaßen beurteilt werden kann. Wie in den repräsentativen Ergebn…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der São Paulo Research Foundation (FAPESP, Zuschuss 2017/00003-0) unterstützt. Wir sind dankbar für die Koordination zur Verbesserung des Hochschulpersonals (CAPES). Wir danken Dr. Anthony R. West, Dr. Heinz Steiner und Dr. Kuei Y. Tseng für die Unterstützung und das Mentoring.
Materials
| 6-OHDA | Sigma Aldrich | H4381 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt®ion=BR&cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel _6-ohda-_-srpRecs3-1 |
| 70% Alcohol | |||
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | 795437 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt®ion=BR&gclid= Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09 _kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO 6yicaAot6EALw_wcB |
| Cotton | |||
| Drill or tap | |||
| Gauze | |||
| Hamilton syringe 50 uL | Hamilton | 80539 | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539 |
| Imipramine | Alfa Aeser | J63723 | https://www.alfa.com/pt/catalog/J63723/ |
| Infusion pump | Insight | EFF-311 | https://insightltda.com.br/produto/eff-311-bomba-de-infusao-2-seringas/ |
| Ketamine (Dopalen) | Ceva | https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/DOPALEN | |
| Machine for trichotomy | |||
| Meloxicam (Maxicam 2% Ourofino) | Ourofino | https://terrazoo.com.br/produto/maxicam-injetavel-2-50ml-ouro-fino/ | |
| Metal Disposal | |||
| Paper towels | |||
| Pentabiotic | Zoetis | https://www.zoetis.com.br/pentabiotico-veterinario.aspx | |
| Plastic waste garbage can | |||
| Poly-antibiotic | Pentabiotic (Wealth) | ||
| Povidone-iodine | |||
| Scalpel and blades | |||
| Scissors | |||
| Scraper | |||
| Stereotaxic apparatus | Insight | EFF-331 | https://insightltda.com.br/produto/eff-331-estereotaxico-1-torre/ |
| Sterile saline solution | |||
| Swabs | |||
| Temperature probe | |||
| Timer | |||
| Tweezers | |||
| Xylazine (Anasedan) | Ceva | https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN |
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