Reconstitutie van Msp1-extractieactiviteit met volledig gezuiverde componenten
Summary
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor reconstitutie van Msp1-extractieactiviteit met volledig gezuiverde componenten in gedefinieerde proteoliposomen.
Abstract
Als centrum voor oxidatieve fosforylering en apoptotische regulatie spelen mitochondriën een vitale rol in de menselijke gezondheid. Een goede mitochondriale functie is afhankelijk van een robuust kwaliteitscontrolesysteem om eiwithomeostase (proteostase) te behouden. Dalingen in mitochondriale proteostase zijn in verband gebracht met kanker, veroudering, neurodegeneratie en vele andere ziekten. Msp1 is een AAA + ATPase verankerd in het buitenste mitochondriale membraan dat proteostase handhaaft door verkeerd gelokaliseerde staartverankerde eiwitten te verwijderen. Met behulp van gezuiverde componenten gereconstitueerd tot proteoliposomen, hebben we aangetoond dat Msp1 noodzakelijk en voldoende is om een model staart-verankerd eiwit uit een lipide bilayer te extraheren. Ons vereenvoudigde gereconstitueerde systeem overwint verschillende van de technische barrières die een gedetailleerde studie van membraaneiwitextractie hebben belemmerd. Hier bieden we gedetailleerde methoden voor het genereren van liposomen, membraaneiwitreconstructie en de Msp1-extractietest.
Introduction
Een goede cellulaire functie hangt af van een proces dat proteostase wordt genoemd, dat ervoor zorgt dat functionele eiwitten zich op de juiste concentratie en cellulaire locatie bevinden1. Mislukkingen in proteostase leiden tot een gecompromitteerde organelfunctie en worden geassocieerd met veel neurodegeneratieve ziekten2,3,4. Membraaneiwitten vormen unieke uitdagingen voor het proteostasenetwerk, omdat ze op het juiste membraan moeten worden gericht, terwijl aggregatie van de hydrofobe transmembraandomeinen (TMD’s) wordt vermeden5. Bijgevolg zijn gespecialiseerde machines geëvolueerd om de hydrofobe TMD te beschermen tegen het cytosol en het richten en inbrengen in het juiste celmembraan6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15te vergemakkelijken.
Mitochondriën zijn de metabole hub van de cel en zijn betrokken bij tal van essentiële cellulaire processen zoals: oxidatieve fosforylering, ijzer-zwavel clustergeneratie en apoptotische regulatie16,17. Deze endosymbiotische organellen bevatten twee membranen, aangeduid als het binnenste mitochondriale membraan (IMM) en het buitenste mitochondriale membraan (OMM). Meer dan 99% van de 1.500 menselijke mitochondriale eiwitten zijn gecodeerd in het nucleaire genoom en moeten worden getransloceerd over een of twee verschillende membranen18,19. Een goede mitochondriale functie is dus afhankelijk van een robuust proteostasenetwerk om eventuele fouten in eiwittargeting of translocatie te corrigeren.
Ons laboratorium richt zich op een subset van mitochondriale membraaneiwitten genaamd staart-verankerde (TA) eiwitten, die een enkel transmembraandomein hebben op het C-eindpunt20,21,22,23,24. TA-eiwitten zijn betrokken bij een aantal essentiële processen, zoals apoptose, vesikeltransport en eiwittranslocatie25. De unieke topologie van TA-eiwitten vereist posttranslationele insertie, die optreedt in het endoplasmatisch reticulum (ER) door de Guided Entry of Tail-anchored (GET) of Endoplasmic reticulum Membrane protein Complex (EMC) pathways of in de OMM door een slecht gekarakteriseerde pathway20,26,27,28. De biofysische eigenschappen van de TMD zijn noodzakelijk en voldoende om TA-eiwitten naar het juiste membraan te leiden29. De herkenning van biofysische kenmerken in plaats van een gedefinieerd sequentiemotief beperkt de getrouwheid van de richtroutes5. Mislokalisatie van TA-eiwitten is dus een veel voorkomende stress voor de proteostasenetwerken. Cellulaire stress, zoals remming van de GET-route, veroorzaakt een toename van eiwitmislokalisatie naar de OMM en mitochondriale disfunctie, tenzij deze eiwitten onmiddellijk worden verwijderd30,31.
Een gemeenschappelijk thema in membraanproteostase is het gebruik van AAA +(ATPase Associated met cellulaire A-ctivities) eiwitten om oude, beschadigde of verkeerd gelokaliseerde eiwitten uit de lipide bilayer1,32,33,34,35,36,37,38 te verwijderen . AAA + -eiwitten zijn moleculaire motoren die hexamere ringen vormen en ATP-afhankelijke bewegingen ondergaan om een substraat te hermodelleren, vaak door translocatie door een smalle axiale porie39,40. Hoewel er veel moeite is gedaan om de extractie van membraaneiwitten door AAA + ATPases te bestuderen, zijn de reconstituties complex of omvatten ze een mengsel van lipiden en wasmiddel41,42, wat de experimentele kracht beperkt om het mechanisme van substraatextractie uit de lipide bilayer te onderzoeken.
Msp1 is een zeer geconserveerde AAA + ATPase verankerd in de OMM en peroxisomen die een cruciale rol speelt in membraanproteostase door het verwijderen van verkeerd gelokaliseerde TA-eiwitten43,44,45,46,47. Msp1 bleek onlangs ook mitochondriale eiwitimportstress te verlichten door membraaneiwitten te verwijderen die vastlopen tijdens translocatie over de OMM48. Verlies van Msp1 of de menselijke homoloog ATAD1 resulteert in mitochondriale fragmentatie, falen in oxidatieve fosforylering, epileptische aanvallen, verhoogd letsel na een beroerte en vroege dood31,49,50,51,52,53,54,55,56.
We hebben aangetoond dat het mogelijk is om TA-eiwitten te co-reconstitueren met Msp1 en de extractie uit de lipide bilayer57 tedetecteren. Dit vereenvoudigde systeem maakt gebruik van volledig gezuiverde eiwitten gereconstitueerd in gedefinieerde liposomen die de OMM nabootsen (Figuur 1)58,59. Dit niveau van experimentele controle kan gedetailleerde mechanistische vragen van substraatextractie aanpakken die experimenteel onhandelbaar zijn met complexere reconstituties waarbij andere AAA + -eiwitten betrokken zijn. Hier bieden we experimentele protocollen met gedetailleerde informatie over onze methoden voor liposoompreparaat, membraaneiwitreconstructie en de extractietest. Het is onze hoop dat deze experimentele details verdere studie van het essentiële maar slecht begrepen proces van membraanproteostase zullen vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een goede mitochondriale functie is afhankelijk van een robuust eiwitkwaliteitscontrolesysteem. Vanwege inherente limieten in de getrouwheid van de TA-eiwitgerichte routes, zijn verkeerd gelokaliseerde TA-eiwitten een constante bron van stress voor mitochondriën. Een belangrijk onderdeel van het mitochondriale proteostasenetwerk is Msp1, een membraan verankerd AAA + ATPase dat verkeerd gelokaliseerde TA-eiwitten uit de OMM verwijdert. Hier hebben we beschreven hoe proteoliposomen te bereiden, Msp1 en een model TA-eiwit …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MLW ontwikkelde een deel van dit protocol tijdens zijn postdoctorale studies met Dr. Robert Keenan aan de Universiteit van Chicago.
Dit werk wordt gefinancierd door NIH-subsidie 1R35GM137904-01 aan MLW.
Materials
| Biobeads | Bio-Rad | 1523920 | |
| Bovine liver phosphatidyl inositol | Avanti | 840042C | PI |
| Chicken egg phosphatidyl choline | Avanti | 840051C | PC |
| Chicken egg phosphatidyl ethanolamine | Avanti | 840021C | PE |
| ECL Select western blotting detection reagent | GE | RPN2235 | |
| Filter supports | Avanti | 610014 | |
| Glass vial | VWR | 60910L-1 | |
| Glutathione spin column | Thermo Fisher | PI16103 | |
| Goat anti-rabbit | Thermo Fisher | NC1050917 | |
| Mini-Extruder | Avanti | 610020 | |
| Polycarbonate membrane | Avanti | 610006 | 200 nM |
| PVDF membrane | Thermo Fisher | 88518 | 45 µM |
| Rabbit anti-FLAG | Sigma-Aldrich | F7245 | |
| Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti | 840035C | DOPS |
| Synthetic 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol | Avanti | 710335C | TOCL |
| Syringe, 1 mL | Norm-Ject | 53548-001 | |
| Syringe, 1 mL, gas-tight | Avanti | 610017 |
Riferimenti
- Song, J., Herrmann, J. M., Becker, T. Quality control of the mitochondrial proteome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22, 54-70 (2021).
- Phillips, B. P., Miller, E. A. Membrane protein folding and quality control. Current Opinion in Structural Biology. 69, 50-54 (2021).
- Jiang, H. Quality control pathways of tail-anchored proteins. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1868, 118922 (2020).
- McKenna, M. J., et al. The endoplasmic reticulum P5A-ATPase is a transmembrane helix dislocase. Science. 369, (2020).
- Hegde, R. S., Zavodszky, E. Recognition and Degradation of Mislocalized Proteins in Health and Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11, 033902 (2019).
- Shao, S., Hegde, R. S. A calmodulin-dependent translocation pathway for small secretory proteins. Cell. 147, 1576-1588 (2011).
- Samuelson, J. C., et al. YidC mediates membrane protein insertion in bacteria. Nature. 406, 637-641 (2000).
- Anghel, S. A., McGilvray, P. T., Hegde, R. S., Keenan, R. J. Identification of Oxa1 Homologs Operating in the Eukaryotic Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21, 3708-3716 (2017).
- Aviram, N., et al. The SND proteins constitute an alternative targeting route to the endoplasmic reticulum. Nature. 540, 134-138 (2016).
- Voorhees, R. M., Hegde, R. S. Structure of the Sec61 channel opened by a signal sequence. Science. 351, 88-91 (2016).
- Cichocki, B. A., Krumpe, K., Vitali, D. G., Rapaport, D. Pex19 is involved in importing dually targeted tail-anchored proteins to both mitochondria and peroxisomes. Traffic. 19, 770-785 (2018).
- Mateja, A., et al. Protein targeting. Structure of the Get3 targeting factor in complex with its membrane protein cargo. Science. 347, 1152-1155 (2015).
- Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138, 628-644 (2009).
- Chitwood, P. J., Hegde, R. S. An intramembrane chaperone complex facilitates membrane protein biogenesis. Nature. , (2020).
- Chitwood, P. J., Juszkiewicz, S., Guna, A., Shao, S., Hegde, R. S. EMC Is Required to Initiate Accurate Membrane Protein Topogenesis. Cell. 175, 1-30 (2018).
- Bock, F. J., Tait, S. W. G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21, 85-100 (2020).
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, (2019).
- Bykov, Y. S., Rapaport, D., Herrmann, J. M., Schuldiner, M. Cytosolic Events in the Biogenesis of Mitochondrial Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 45, 650-667 (2020).
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 427, 1135 (2019).
- Borgese, N., Coy-Vergara, J., Colombo, S. F., Schwappach, B. The Ways of Tails: the GET Pathway and more. The Protein Journal. , 1-17 (2019).
- Mateja, A., Keenan, R. J. A structural perspective on tail-anchored protein biogenesis by the GET pathway. Current Opinion in Structural Biology. 51, 195-202 (2018).
- Chio, U. S., Cho, H., Shan, S. Mechanisms of Tail-Anchored Membrane Protein Targeting and Insertion. Annual review of cell and developmental biology. 33, 417-438 (2017).
- Denic, V. A portrait of the GET pathway as a surprisingly complicated young man. Trends in biochemical sciences. , (2012).
- Hegde, R. S., Keenan, R. J. Tail-anchored membrane protein insertion into the endoplasmic reticulum. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12, 787-798 (2011).
- Kalbfleisch, T., Cambon, A., Wattenberg, B. W. A bioinformatics approach to identifying tail-anchored proteins in the human genome. Traffic. 8, 1687-1694 (2007).
- Doan, K. N., et al. The Mitochondrial Import Complex MIM Functions as Main Translocase for α-Helical Outer Membrane Proteins. Cell Reports. 31, (2020).
- McDowell, M. A., et al. Structural Basis of Tail-Anchored Membrane Protein Biogenesis by the GET Insertase Complex. Molecular Cell. 80, (2020).
- Guna, A., Volkmar, N., Christianson, J. C., Hegde, R. S. The ER membrane protein complex is a transmembrane domain insertase. Science. 591, 3099 (2017).
- Rao, M., et al. Multiple selection filters ensure accurate tail-anchored membrane protein targeting. eLife. 5, 21301 (2016).
- Schuldiner, M., et al. The GET complex mediates insertion of tail-anchored proteins into the ER membrane. Cell. 134, 634-645 (2008).
- Chen, Y. -. C., et al. Msp1/ATAD1 maintains mitochondrial function by facilitating the degradation of mislocalized tail-anchored proteins. The EMBO journal. 33, 1548-1564 (2014).
- Wu, X., Rapoport, T. A. Translocation of Proteins through a Distorted Lipid Bilayer. Trends in Cell Biology. , (2021).
- Phillips, B. P., Gomez-Navarro, N., Miller, E. A. Protein quality control in the endoplasmic reticulum. Current Opinion in Cell Biology. 65, 96-102 (2020).
- van de Weijer, M. L., et al. Quality Control of ER Membrane Proteins by the RNF185/Membralin Ubiquitin Ligase Complex. Molecular Cell. 79, (2020).
- Weir, N. R., Kamber, R. A., Martenson, J. S., Denic, V. The AAA protein Msp1 mediates clearance of excess tail-anchored proteins from the peroxisomal membrane. eLife. 6, 28507 (2017).
- Gardner, B. M., et al. The peroxisomal AAA-ATPase Pex1/Pex6 unfolds substrates by processive threading. Nature communications. 9, 135 (2018).
- Puchades, C., et al. Unique Structural Features of the Mitochondrial AAA+ Protease AFG3L2 Reveal the Molecular Basis for Activity in Health and Disease. Molecular Cell. , (2019).
- Castanzo, D. T., LaFrance, B., Martin, A. The AAA+ ATPase Msp1 is a processive protein translocase with robust unfoldase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 14970-14977 (2020).
- Wang, L., Myasnikov, A., Pan, X., Walter, P. Structure of the AAA protein Msp1 reveals mechanism of mislocalized membrane protein extraction. eLife. 9, (2020).
- Puchades, C., Sandate, C. R., Lander, G. C. The molecular principles governing the activity and functional diversity of AAA+ proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , 1-16 (2019).
- Yang, Y., et al. Folding-Degradation Relationship of a Membrane Protein Mediated by the Universally Conserved ATP-Dependent Protease FtsH. Journal of the American Chemical Society. , 10 (2018).
- Baldridge, R. D., Rapoport, T. A. Autoubiquitination of the Hrd1 Ligase Triggers Protein Retrotranslocation in ERAD. Cell. 166, 394-407 (2016).
- Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Sorting out how Msp1 maintains mitochondrial membrane proteostasis. Mitochondrion. 49, 128-134 (2019).
- Wang, L., Walter, P. Msp1/ATAD1 in Protein Quality Control and Regulation of Synaptic Activities. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 1-24 (2020).
- Dederer, V., et al. Cooperation of mitochondrial and ER factors in quality control of tail-anchored proteins. eLife. 8, 1126 (2019).
- Matsumoto, S., et al. Msp1 Clears Mistargeted Proteins by Facilitating Their Transfer from Mitochondria to the ER. Molecular Cell. , (2019).
- Li, L., Zheng, J., Wu, X., Jiang, H. Mitochondrial AAA-ATPase Msp1 detects mislocalized tail-anchored proteins through a dual-recognition mechanism. EMBO Reports. 20, (2019).
- Weidberg, H., Amon, A. MitoCPR – a surveillance pathway that protects mitochondria in response to protein import stress. Science. 360, (2018).
- Okreglak, V., Walter, P. The conserved AAA-ATPase Msp1 confers organelle specificity to tail-anchored proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (2014).
- Piard, J., et al. A homozygous ATAD1 mutation impairs postsynaptic AMPA receptor trafficking and causes a lethal encephalopathy. Brain. , (2018).
- Zhang, J., et al. The AAA+ ATPase Thorase regulates AMPA receptor-dependent synaptic plasticity and behavior. Cell. 145, 284-299 (2011).
- Prendergast, J., et al. Ganglioside regulation of AMPA receptor trafficking. The Journal of Neuroscience. 34, 13246-13258 (2014).
- Umanah, G. K. E., et al. Thorase variants are associated with defects in glutamatergic neurotransmission that can be rescued by Perampanel. Science Translational Medicine. 9, 4985 (2017).
- Pignatelli, M., et al. Synaptic Plasticity onto Dopamine Neurons Shapes Fear Learning. Neuron. 93, 425-440 (2017).
- Zhang, J., et al. The AAA Thorase is neuroprotective against ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , 271678 (2018).
- Umanah, G. K. E., et al. AMPA Receptor Surface Expression Is Regulated by S-Nitrosylation of Thorase and Transnitrosylation of NSF. Cell Reports. 33, 108329 (2020).
- Wohlever, M. L., Mateja, A., McGilvray, P. T., Day, K. J., Keenan, R. J. Msp1 Is a Membrane Protein Dislocase for Tail-Anchored Proteins. Molecular Cell. 67, 194-202 (2017).
- Lovell, J. F., et al. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cell. 135, 1074-1084 (2008).
- Leshchiner, E. S., Braun, C. R., Bird, G. H., Walensky, L. D. Direct activation of full-length proapoptotic BAK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 986-995 (2013).
