Rekonstitution af Msp1 udvindingsaktivitet med fuldt rensede komponenter
Summary
Her præsenterer vi en detaljeret protokol for rekonstitution af Msp1 ekstraktionsaktivitet med fuldt rensede komponenter i definerede proteolipoomer.
Abstract
Som centrum for oxidativ fosforylering og apoptotisk regulering spiller mitokondrier en afgørende rolle i menneskers sundhed. Korrekt mitokondriefunktion afhænger af et robust kvalitetskontrolsystem for at opretholde protein homøostase (proteostase). Fald i mitokondrie proteostase har været forbundet med kræft, aldring, neurodegeneration, og mange andre sygdomme. Msp1 er en AAA+ ATPase forankret i den ydre mitokondriemembran, der opretholder proteostase ved at fjerne fejllokerede haleforankrede proteiner. Ved hjælp af rensede komponenter rekonstitueret i proteoliposomes, har vi vist, at Msp1 er nødvendig og tilstrækkelig til at udtrække en model hale-forankret protein fra en lipid bilayer. Vores forenklede rekonstituerede system overvinder flere af de tekniske barrierer, der har hindret detaljeret undersøgelse af membranproteinudvinding. Her giver vi detaljerede metoder til generering af liposomer, membranprotein rekonstitution, og Msp1 ekstraktion assay.
Introduction
Korrekt cellulær funktion afhænger af en proces kaldet proteostase, som sikrer, at funktionelle proteiner er i den korrekte koncentration og cellulære placering1. Fejl i proteostase fører til kompromitteret organellefunktion og er forbundet med mange neurodegenerative sygdomme2,3,4. Membranproteiner udgør unikke udfordringer for proteostasenetværket, da de skal målrettes mod den korrekte membran, samtidig med at man undgår sammenlægning fra hydrofobiske transmembrandomæner (TED’er)5. Derfor har specialiserede maskiner udviklet sig til at beskytte den hydrofobiske TMD fra cytosolen og lette målretning og indsættelse i den korrekte cellulæremembran 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Mitokondrier er cellens metaboliske knudepunkt og er involveret i mange væsentlige cellulære processer som: oxidativ fosforylering, jern-svovlklyngegenerering og apoptotisk regulering16,17. Disse endosymbiotiske organeller indeholder to membraner, kaldet den indre mitokondriemembran (IMM) og den ydre mitokondriemembran (OMM). Over 99% af de 1.500 humane mitokondrieproteiner er kodet i det nukleare genom og skal omfordeles på tværs af en eller to forskellige membraner18,19. Korrekt mitokondriefunktion afhænger således af et robust proteostasenetværk for at rette eventuelle fejl i proteinmålretning eller translokation.
Vores laboratorium fokuserer på en delmængde af mitokondriemembranproteiner kaldet haleforankrede (TA) proteiner, som har et enkelt transmembrandomæne på selve C-terminus20,21,22,23,24. TA proteiner er involveret i en række væsentlige processer, såsom apoptose, vesikel transport, og protein translokation25. Den unikke topologi af TA proteiner kræver post-translationel indsættelse, som forekommer i endoplasmisk reticulum (ER) ved Guided Entry of Tail-forankret (GET) eller Endoplasmic reticulum Membrane protein Complex (EMC) veje eller ind i OMM af en dårligt karakteriseret vej20,26,27,28. TMD’ens biofysiske egenskaber er nødvendige og tilstrækkelige til at lede TA-proteiner til den korrektemembran 29. Anerkendelsen af biofysiske egenskaber snarere end et defineret sekvensmotiv begrænser troskaben af målretningsvejene5. Således er fejllocalization af TA proteiner en fælles stress for proteostase netværk. Cellulær stress, såsom hæmning af GET-stien, forårsager en stigning i proteinfejllocalisering til OMM og mitokondrie dysfunktion, medmindre disse proteiner straks fjernes30,31.
Et fælles tema i membran proteostase er brugen af AAA +(ATPase Associated med cellulære Activities) proteiner til at fjerne gamle, beskadigede eller fejllokerede proteiner fra lipid bilayer1,32,33,34,35,36,37,38 . AAA + proteiner er molekylære motorer, der danner hexameriske ringe og gennemgår ATP-afhængige bevægelser for at ombygge et substrat, ofte ved translokation gennem en smal aksial pore39,40. Selv om der er gjort en stor indsats for at studere udvindingen af membranproteiner af AAA + ATPases, er rekonstitutionerne komplekse eller involverer en blanding af lipider og vaskemiddel41,42, hvilket begrænser den eksperimentelle kraft til at undersøge mekanismen for substratudvinding fra lipid-bilayeren.
Msp1 er en meget bevaret AAA + ATPase forankret i OMM og peroxisomes, der spiller en afgørende rolle i membran proteostase ved at fjerne fejllokaliserede TA proteiner43,44,45,46,47. Msp1 blev også for nylig vist sig at lindre mitokondrie protein import stress ved at fjerne membran proteiner, stall under translokation på tværs af OMM48. Tab af Msp1 eller den menneskelige homolog ATAD1 resulterer i mitokondrie fragmentering, svigt i oxidativ fosforylering, anfald, øget skade efter slagtilfælde, og tidlig død31,49,50,51,52,53,54,55,56.
Vi har vist, at det er muligt at co-rekonstruere TA proteiner med Msp1 og opdage ekstraktionen fra lipid bilayer57. Dette forenklede system anvender fuldt rensede proteiner rekonstitueret i definerede liposomer , der efterligner OMM (Figur 1)58,59. Dette niveau af eksperimentel kontrol kan løse detaljerede mekanistiske spørgsmål om substratudvinding, der er eksperimentelt uhåndterlige med mere komplekse rekonstitutioner, der involverer andre AAA+ proteiner. Her leverer vi eksperimentelle protokoller, der beskriver vores metoder til liposompræparat, membranproteinkonstitution og ekstraktionsanalysen. Det er vores håb, at disse eksperimentelle detaljer vil lette yderligere undersøgelse af den væsentlige, men dårligt forstået proces med membran proteostase.
Protocol
Representative Results
Discussion
Korrekt mitokondriefunktion afhænger af et robust proteinkvalitetskontrolsystem. På grund af iboende grænser i troskab ta protein målretning veje, mislocalized TA proteiner er en konstant kilde til stress for mitokondrier. En vigtig komponent i mitokondrie proteostase netværk er Msp1, som er en membran forankret AAA + ATPase, der fjerner fejllocalized TA proteiner fra OMM. Her har vi beskrevet, hvordan man forbereder proteoliposomes, co-rekonstrueret Msp1 og en model TA protein, og udføre en ekstraktion assay. Vi h…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MLW udviklede en del af denne protokol under sine postdocstudier med Dr. Robert Keenan ved University of Chicago.
Dette arbejde er finansieret af NIH tilskud 1R35GM137904-01 til MLW.
Materials
| Biobeads | Bio-Rad | 1523920 | |
| Bovine liver phosphatidyl inositol | Avanti | 840042C | PI |
| Chicken egg phosphatidyl choline | Avanti | 840051C | PC |
| Chicken egg phosphatidyl ethanolamine | Avanti | 840021C | PE |
| ECL Select western blotting detection reagent | GE | RPN2235 | |
| Filter supports | Avanti | 610014 | |
| Glass vial | VWR | 60910L-1 | |
| Glutathione spin column | Thermo Fisher | PI16103 | |
| Goat anti-rabbit | Thermo Fisher | NC1050917 | |
| Mini-Extruder | Avanti | 610020 | |
| Polycarbonate membrane | Avanti | 610006 | 200 nM |
| PVDF membrane | Thermo Fisher | 88518 | 45 µM |
| Rabbit anti-FLAG | Sigma-Aldrich | F7245 | |
| Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti | 840035C | DOPS |
| Synthetic 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol | Avanti | 710335C | TOCL |
| Syringe, 1 mL | Norm-Ject | 53548-001 | |
| Syringe, 1 mL, gas-tight | Avanti | 610017 |
Riferimenti
- Song, J., Herrmann, J. M., Becker, T. Quality control of the mitochondrial proteome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22, 54-70 (2021).
- Phillips, B. P., Miller, E. A. Membrane protein folding and quality control. Current Opinion in Structural Biology. 69, 50-54 (2021).
- Jiang, H. Quality control pathways of tail-anchored proteins. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1868, 118922 (2020).
- McKenna, M. J., et al. The endoplasmic reticulum P5A-ATPase is a transmembrane helix dislocase. Science. 369, (2020).
- Hegde, R. S., Zavodszky, E. Recognition and Degradation of Mislocalized Proteins in Health and Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11, 033902 (2019).
- Shao, S., Hegde, R. S. A calmodulin-dependent translocation pathway for small secretory proteins. Cell. 147, 1576-1588 (2011).
- Samuelson, J. C., et al. YidC mediates membrane protein insertion in bacteria. Nature. 406, 637-641 (2000).
- Anghel, S. A., McGilvray, P. T., Hegde, R. S., Keenan, R. J. Identification of Oxa1 Homologs Operating in the Eukaryotic Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21, 3708-3716 (2017).
- Aviram, N., et al. The SND proteins constitute an alternative targeting route to the endoplasmic reticulum. Nature. 540, 134-138 (2016).
- Voorhees, R. M., Hegde, R. S. Structure of the Sec61 channel opened by a signal sequence. Science. 351, 88-91 (2016).
- Cichocki, B. A., Krumpe, K., Vitali, D. G., Rapaport, D. Pex19 is involved in importing dually targeted tail-anchored proteins to both mitochondria and peroxisomes. Traffic. 19, 770-785 (2018).
- Mateja, A., et al. Protein targeting. Structure of the Get3 targeting factor in complex with its membrane protein cargo. Science. 347, 1152-1155 (2015).
- Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138, 628-644 (2009).
- Chitwood, P. J., Hegde, R. S. An intramembrane chaperone complex facilitates membrane protein biogenesis. Nature. , (2020).
- Chitwood, P. J., Juszkiewicz, S., Guna, A., Shao, S., Hegde, R. S. EMC Is Required to Initiate Accurate Membrane Protein Topogenesis. Cell. 175, 1-30 (2018).
- Bock, F. J., Tait, S. W. G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21, 85-100 (2020).
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, (2019).
- Bykov, Y. S., Rapaport, D., Herrmann, J. M., Schuldiner, M. Cytosolic Events in the Biogenesis of Mitochondrial Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 45, 650-667 (2020).
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 427, 1135 (2019).
- Borgese, N., Coy-Vergara, J., Colombo, S. F., Schwappach, B. The Ways of Tails: the GET Pathway and more. The Protein Journal. , 1-17 (2019).
- Mateja, A., Keenan, R. J. A structural perspective on tail-anchored protein biogenesis by the GET pathway. Current Opinion in Structural Biology. 51, 195-202 (2018).
- Chio, U. S., Cho, H., Shan, S. Mechanisms of Tail-Anchored Membrane Protein Targeting and Insertion. Annual review of cell and developmental biology. 33, 417-438 (2017).
- Denic, V. A portrait of the GET pathway as a surprisingly complicated young man. Trends in biochemical sciences. , (2012).
- Hegde, R. S., Keenan, R. J. Tail-anchored membrane protein insertion into the endoplasmic reticulum. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12, 787-798 (2011).
- Kalbfleisch, T., Cambon, A., Wattenberg, B. W. A bioinformatics approach to identifying tail-anchored proteins in the human genome. Traffic. 8, 1687-1694 (2007).
- Doan, K. N., et al. The Mitochondrial Import Complex MIM Functions as Main Translocase for α-Helical Outer Membrane Proteins. Cell Reports. 31, (2020).
- McDowell, M. A., et al. Structural Basis of Tail-Anchored Membrane Protein Biogenesis by the GET Insertase Complex. Molecular Cell. 80, (2020).
- Guna, A., Volkmar, N., Christianson, J. C., Hegde, R. S. The ER membrane protein complex is a transmembrane domain insertase. Science. 591, 3099 (2017).
- Rao, M., et al. Multiple selection filters ensure accurate tail-anchored membrane protein targeting. eLife. 5, 21301 (2016).
- Schuldiner, M., et al. The GET complex mediates insertion of tail-anchored proteins into the ER membrane. Cell. 134, 634-645 (2008).
- Chen, Y. -. C., et al. Msp1/ATAD1 maintains mitochondrial function by facilitating the degradation of mislocalized tail-anchored proteins. The EMBO journal. 33, 1548-1564 (2014).
- Wu, X., Rapoport, T. A. Translocation of Proteins through a Distorted Lipid Bilayer. Trends in Cell Biology. , (2021).
- Phillips, B. P., Gomez-Navarro, N., Miller, E. A. Protein quality control in the endoplasmic reticulum. Current Opinion in Cell Biology. 65, 96-102 (2020).
- van de Weijer, M. L., et al. Quality Control of ER Membrane Proteins by the RNF185/Membralin Ubiquitin Ligase Complex. Molecular Cell. 79, (2020).
- Weir, N. R., Kamber, R. A., Martenson, J. S., Denic, V. The AAA protein Msp1 mediates clearance of excess tail-anchored proteins from the peroxisomal membrane. eLife. 6, 28507 (2017).
- Gardner, B. M., et al. The peroxisomal AAA-ATPase Pex1/Pex6 unfolds substrates by processive threading. Nature communications. 9, 135 (2018).
- Puchades, C., et al. Unique Structural Features of the Mitochondrial AAA+ Protease AFG3L2 Reveal the Molecular Basis for Activity in Health and Disease. Molecular Cell. , (2019).
- Castanzo, D. T., LaFrance, B., Martin, A. The AAA+ ATPase Msp1 is a processive protein translocase with robust unfoldase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 14970-14977 (2020).
- Wang, L., Myasnikov, A., Pan, X., Walter, P. Structure of the AAA protein Msp1 reveals mechanism of mislocalized membrane protein extraction. eLife. 9, (2020).
- Puchades, C., Sandate, C. R., Lander, G. C. The molecular principles governing the activity and functional diversity of AAA+ proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , 1-16 (2019).
- Yang, Y., et al. Folding-Degradation Relationship of a Membrane Protein Mediated by the Universally Conserved ATP-Dependent Protease FtsH. Journal of the American Chemical Society. , 10 (2018).
- Baldridge, R. D., Rapoport, T. A. Autoubiquitination of the Hrd1 Ligase Triggers Protein Retrotranslocation in ERAD. Cell. 166, 394-407 (2016).
- Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Sorting out how Msp1 maintains mitochondrial membrane proteostasis. Mitochondrion. 49, 128-134 (2019).
- Wang, L., Walter, P. Msp1/ATAD1 in Protein Quality Control and Regulation of Synaptic Activities. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 1-24 (2020).
- Dederer, V., et al. Cooperation of mitochondrial and ER factors in quality control of tail-anchored proteins. eLife. 8, 1126 (2019).
- Matsumoto, S., et al. Msp1 Clears Mistargeted Proteins by Facilitating Their Transfer from Mitochondria to the ER. Molecular Cell. , (2019).
- Li, L., Zheng, J., Wu, X., Jiang, H. Mitochondrial AAA-ATPase Msp1 detects mislocalized tail-anchored proteins through a dual-recognition mechanism. EMBO Reports. 20, (2019).
- Weidberg, H., Amon, A. MitoCPR – a surveillance pathway that protects mitochondria in response to protein import stress. Science. 360, (2018).
- Okreglak, V., Walter, P. The conserved AAA-ATPase Msp1 confers organelle specificity to tail-anchored proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (2014).
- Piard, J., et al. A homozygous ATAD1 mutation impairs postsynaptic AMPA receptor trafficking and causes a lethal encephalopathy. Brain. , (2018).
- Zhang, J., et al. The AAA+ ATPase Thorase regulates AMPA receptor-dependent synaptic plasticity and behavior. Cell. 145, 284-299 (2011).
- Prendergast, J., et al. Ganglioside regulation of AMPA receptor trafficking. The Journal of Neuroscience. 34, 13246-13258 (2014).
- Umanah, G. K. E., et al. Thorase variants are associated with defects in glutamatergic neurotransmission that can be rescued by Perampanel. Science Translational Medicine. 9, 4985 (2017).
- Pignatelli, M., et al. Synaptic Plasticity onto Dopamine Neurons Shapes Fear Learning. Neuron. 93, 425-440 (2017).
- Zhang, J., et al. The AAA Thorase is neuroprotective against ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , 271678 (2018).
- Umanah, G. K. E., et al. AMPA Receptor Surface Expression Is Regulated by S-Nitrosylation of Thorase and Transnitrosylation of NSF. Cell Reports. 33, 108329 (2020).
- Wohlever, M. L., Mateja, A., McGilvray, P. T., Day, K. J., Keenan, R. J. Msp1 Is a Membrane Protein Dislocase for Tail-Anchored Proteins. Molecular Cell. 67, 194-202 (2017).
- Lovell, J. F., et al. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cell. 135, 1074-1084 (2008).
- Leshchiner, E. S., Braun, C. R., Bird, G. H., Walensky, L. D. Direct activation of full-length proapoptotic BAK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 986-995 (2013).
