Rekonstitution der Msp1-Extraktionsaktivität mit vollständig gereinigten Komponenten
Summary
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Rekonstitution der Msp1-Extraktionsaktivität mit vollständig gereinigten Komponenten in definierten Proteoliposomen vor.
Abstract
Als Zentrum für oxidative Phosphorylierung und apoptotische Regulation spielen Mitochondrien eine wichtige Rolle für die menschliche Gesundheit. Die richtige mitochondriale Funktion hängt von einem robusten Qualitätskontrollsystem ab, um die Proteinhomöostase (Proteostase) aufrechtzuerhalten. Der Rückgang der mitochondrialen Proteostase wurde mit Krebs, Alterung, Neurodegeneration und vielen anderen Krankheiten in Verbindung gebracht. Msp1 ist eine AAA+ ATPase, die in der äußeren mitochondrialen Membran verankert ist und die Proteostase aufrechterhält, indem sie falsch lokalisierte schwanzverankerte Proteine entfernt. Unter Verwendung von gereinigten Komponenten, die zu Proteoliposomen rekonstituiert wurden, haben wir gezeigt, dass Msp1 notwendig und ausreichend ist, um ein modellhaftes schwanzverankertes Protein aus einer Lipiddoppelschicht zu extrahieren. Unser vereinfachtes rekonstituiertes System überwindet mehrere der technischen Barrieren, die eine detaillierte Untersuchung der Membranproteinextraktion behindert haben. Hier stellen wir detaillierte Methoden zur Generierung von Liposomen, zur Membranproteinrekonstitution und zum Msp1-Extraktionsassay zur Verfügung.
Introduction
Die richtige zelluläre Funktion hängt von einem Prozess namens Proteostase ab, der sicherstellt, dass funktionelle Proteine in der richtigen Konzentration und zellulären Position sind1. Versagen in der Proteostase führen zu einer beeinträchtigten Organellenfunktion und sind mit vielen neurodegenerativen Erkrankungen verbunden2,3,4. Membranproteine stellen einzigartige Herausforderungen an das Proteostasenetzwerk dar, da sie auf die richtige Membran ausgerichtet werden müssen, während die Aggregation aus den hydrophoben Transmembrandomänen (TMDs) vermieden wird5. Folglich hat sich eine spezielle Maschinerie entwickelt, um die hydrophobe TMD vom Zytosol abzuschirmen und das Zielen und Einsetzen in die richtige Zellmembran zu erleichtern6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Mitochondrien sind das metabolische Zentrum der Zelle und an zahlreichen essentiellen zellulären Prozessen beteiligt, wie zum Beispiel: oxidative Phosphorylierung, Eisen-Schwefel-Cluster-Erzeugung und apoptotische Regulation16,17. Diese endosymbiotischen Organellen enthalten zwei Membranen, die als innere mitochondriale Membran (IMM) und äußere mitochondriale Membran (OMM) bezeichnet werden. Über 99% der 1.500 menschlichen mitochondrialen Proteine sind im Kerngenom kodiert und müssen über eine oder zwei verschiedene Membranen transloziert werden18,19. Die richtige mitochondriale Funktion hängt daher von einem robusten Proteostasenetzwerk ab, um Fehler beim Protein-Targeting oder bei der Translokation zu korrigieren.
Unser Labor konzentriert sich auf eine Untergruppe von mitochondrialen Membranproteinen, die als schwanzverankerte (TA) Proteine bezeichnet werden und eine einzelne Transmembrandomäne am C-Terminus20,21,22,23,24haben. TA-Proteine sind an einer Reihe von essentiellen Prozessen beteiligt, wie Apoptose, Vesikeltransport und Proteintranslokation25. Die einzigartige Topologie von TA-Proteinen erfordert eine posttranslationale Insertion, die im endoplasmatischen Retikulum (ER) durch den geführten Eintritt von Tail-verankerten (GET) oder endoplasmatischen Retikulummembranproteinkomplex (EMC) -Signalwegen oder in das OMM durch einen schlecht charakterisierten Wegauftritt 20,26,27,28. Die biophysikalischen Eigenschaften des TMD sind notwendig und ausreichend, um TA-Proteine zur richtigen Membran zu führen29. Die Erkennung biophysikalischer Merkmale anstelle eines definierten Sequenzmotivs schränkt die Genauigkeit der Targeting-Pfade ein5. Daher ist die Fehllokalisierung von TA-Proteinen ein häufiger Stress für die Proteostase-Netzwerke. Zellulärer Stress, wie die Hemmung des GET-Signalwegs, verursacht eine Zunahme der Proteinfehllokalisierung zum OMM und mitochondriale Dysfunktion, es sei denn, diese Proteine werden sofort entfernt30,31.
Ein häufiges Thema in der Membranproteostase ist die Verwendung von AAA+(ATPase Associated with cellular Activities) Proteinen, um alte, beschädigte oder fehllokalisierte Proteine aus der Lipiddoppelschicht1,32,33,34,35,36,37,38 zu entfernen . AAA+-Proteine sind molekulare Motoren, die hexamere Ringe bilden und ATP-abhängigen Bewegungen unterzogen werden, um ein Substrat umzugestalten, oft durch Translokation durch eine schmale axiale Pore39,40. Obwohl große Anstrengungen unternommen wurden, um die Extraktion von Membranproteinen durch AAA + ATPasen zu untersuchen, sind die Rekonstitutionen komplex oder beinhalten eine Mischung aus Lipiden und Waschmittel41,42, was die experimentelle Kraft begrenzt, den Mechanismus der Substratextraktion aus der Lipiddoppelschicht zu untersuchen.
Msp1 ist eine hochkonservierte AAA+ ATPase, die im OMM und in den Peroxisomen verankert ist und eine entscheidende Rolle bei der Membranproteostase spielt, indem sie fehllokalisierte TA-Proteine43,44,45,46,47entfernt. Es wurde kürzlich auch gezeigt, dass Msp1 den mitochondrialen Proteinimportstress lindert, indem es Membranproteine entfernt, die während der Translokation über das OMM48zum Stillstand kommen. Der Verlust von Msp1 oder des menschlichen Homologs ATAD1 führt zu mitochondrialer Fragmentierung, Versagen bei der oxidativen Phosphorylierung, Krampfanfällen, erhöhten Verletzungen nach Schlaganfall und frühem Tod31,49,50,51,52,53,54,55,56.
Wir haben gezeigt, dass es möglich ist, TA-Proteine mit Msp1 ko-rekonstituieren und die Extraktion aus der Lipiddoppelschicht57nachzuweisen. Dieses vereinfachte System verwendet vollständig gereinigte Proteine, die zu definierten Liposomen rekonstituiert sind, die das OMM nachahmen (Abbildung 1)58,59. Diese Ebene der experimentellen Kontrolle kann detaillierte mechanistische Fragen der Substratextraktion angehen, die experimentell unlösbar sind, mit komplexeren Rekonstitutionen, an denen andere AAA+ Proteine beteiligt sind. Hier stellen wir experimentelle Protokolle zur Verfügung, die unsere Methoden zur Liposomenpräparation, zur Membranproteinrekonstitution und zum Extraktionsassay beschreiben. Wir hoffen, dass diese experimentellen Details die weitere Untersuchung des wesentlichen, aber wenig verstandenen Prozesses der Membranproteostase erleichtern werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die richtige mitochondriale Funktion hängt von einem robusten Proteinqualitätskontrollsystem ab. Aufgrund inhärenter Grenzen in der Genauigkeit der TA-Protein-Targeting-Pfade sind falsch lokalisierte TA-Proteine eine ständige Stressquelle für Mitochondrien. Eine Schlüsselkomponente des mitochondrialen Proteostasenetzwerks ist Msp1, eine membranverankerte AAA + ATPase, die fehllokalisierte TA-Proteine aus dem OMM entfernt. Hier haben wir beschrieben, wie man Proteoliposomen herstellt, Msp1 und ein Modell-TA-Protein …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MLW entwickelte einen Teil dieses Protokolls während seines Postdoc-Studiums bei Dr. Robert Keenan an der University of Chicago.
Diese Arbeit wird durch den NIH-Zuschuss 1R35GM137904-01 an MLW finanziert.
Materials
| Biobeads | Bio-Rad | 1523920 | |
| Bovine liver phosphatidyl inositol | Avanti | 840042C | PI |
| Chicken egg phosphatidyl choline | Avanti | 840051C | PC |
| Chicken egg phosphatidyl ethanolamine | Avanti | 840021C | PE |
| ECL Select western blotting detection reagent | GE | RPN2235 | |
| Filter supports | Avanti | 610014 | |
| Glass vial | VWR | 60910L-1 | |
| Glutathione spin column | Thermo Fisher | PI16103 | |
| Goat anti-rabbit | Thermo Fisher | NC1050917 | |
| Mini-Extruder | Avanti | 610020 | |
| Polycarbonate membrane | Avanti | 610006 | 200 nM |
| PVDF membrane | Thermo Fisher | 88518 | 45 µM |
| Rabbit anti-FLAG | Sigma-Aldrich | F7245 | |
| Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti | 840035C | DOPS |
| Synthetic 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol | Avanti | 710335C | TOCL |
| Syringe, 1 mL | Norm-Ject | 53548-001 | |
| Syringe, 1 mL, gas-tight | Avanti | 610017 |
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