पूरी तरह से शुद्ध घटकों के साथ Msp1 निष्कर्षण गतिविधि का पुनर्गठन
Summary
यहां, हम परिभाषित प्रोटेओलिपोसोम में पूरी तरह से शुद्ध घटकों के साथ Msp1 निष्कर्षण गतिविधि के पुनर्गठन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन और एपोपॉटिक विनियमन के केंद्र के रूप में, माइटोकॉन्ड्रिया मानव स्वास्थ्य में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। उचित माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन प्रोटीन होयोस्टेसिस (प्रोटेओस्टेसिस) को बनाए रखने के लिए एक मजबूत गुणवत्ता नियंत्रण प्रणाली पर निर्भर करता है। माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटेओस्टेसिस में गिरावट कैंसर, उम्र बढ़ने, न्यूरोडिजेनरेशन और कई अन्य बीमारियों से जुड़ी हुई है। एमएसपी1 बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में लंगर डाले गए एएए + एटीपेस है जो गलतोकारित पूंछ-लंगरित प्रोटीन को हटाकर प्रोटेओस्टेसिस को बनाए रखता है। प्रोटियोलिपोसोम्स में पुनर्गठित शुद्ध घटकों का उपयोग करते हुए, हमने दिखाया है कि एमएसपी1 एक लिपिड बाइलेयर से एक मॉडल पूंछ-लंगरित प्रोटीन निकालने के लिए आवश्यक और पर्याप्त है। हमारी सरलीकृत पुनर्गठित प्रणाली कई तकनीकी बाधाओं पर काबू पा रही है जिन्होंने झिल्ली प्रोटीन निष्कर्षण के विस्तृत अध्ययन में रुकावट पैदा की है। यहां, हम लिपोसोम्स, झिल्ली प्रोटीन पुनर्गठन, और Msp1 निष्कर्षण परख की पीढ़ी के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करते हैं।
Introduction
उचित सेलुलर फ़ंक्शन प्रोटेओस्टेसिस नामक प्रक्रिया पर निर्भर करता है, जो यह सुनिश्चित करता है कि कार्यात्मक प्रोटीन सही एकाग्रता और सेलुलर स्थान1पर हैं। प्रोटेओस्टेसिस में विफलताओं से ऑर्गेनेल कार्य से समझौता हो जाता है और वे कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों से जुड़ेहोतेहैं 2,3,4. झिल्ली प्रोटीन प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क के लिए अनूठी चुनौतियां पेश करते हैं क्योंकि हाइड्रोफोबिक ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन (टीएमडी) 5 से एकत्रीकरण से बचतेहुएउन्हें सही झिल्ली के लिए लक्षित किया जाना चाहिए। नतीजतन, हाइड्रोफोबिक टीएमडी को साइटोसोल से बचाने और उचित सेलुलर झिल्ली 6 , 7 ,8, 9 , 10 , 11 ,12,13,14,15 में लक्ष्यीकरण और सम्मिलन की सुविधा प्रदान करने के लिए विशेषमशीनरीविकसित हुई है ।
माइटोकॉन्ड्रिया सेल का मेटाबोलिक हब है और कई आवश्यक सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल है जैसे: ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन, आयरन-सल्फर क्लस्टर जनरेशन, और एपोटोटिक विनियमन16,17। इन एंडोसिमैटिक ऑर्गेनेल्स में दो झिल्ली होती हैं, जिन्हें आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली (आईएमएम) और बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली (ओएमएम) के रूप में जाना जाता है। 1,500 मानव माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन में से 99% से अधिक परमाणु जीनोम में एन्कोड किए जाते हैं और उन्हें18,19में एक या दो अलग झिल्ली में स्थानांतरित करने की आवश्यकता होती है। इस प्रकार उचित माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन प्रोटीन टार्गेटिंग या स्थानांतरण में किसी भी त्रुटि को ठीक करने के लिए एक मजबूत प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क पर निर्भर करता है।
हमारी प्रयोगशाला माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली प्रोटीन के सबसेट पर केंद्रित है जिसे टेल-एंकर (टीए) प्रोटीन कहा जाता है, जिसमें सी-टर्मिनस20, 21, 22,23,24में एक ही ट्रांसमेम्ब्रान डोमेन होता है। टीए प्रोटीन कई आवश्यक प्रक्रियाओं में शामिल होते हैं, जैसे एपोप्टोसिस, वेसिकल परिवहन, और प्रोटीन ट्रांसलोकेशन25। टीए प्रोटीन के अद्वितीय टोपोलॉजी में पोस्ट-ट्रांसलेशनल प्रविष्टि की आवश्यकता होती है, जो टेल-एंकर (जीईटी) या एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम झिल्ली प्रोटीन कॉम्प्लेक्स (ईएमसी) मार्गों के निर्देशित प्रवेश द्वारा एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) में होता है या ओएमएम में खराब विशेषता वाले मार्ग20,26,27,28द्वारा होता है। टीएमडी के जैव भौतिक गुण आवश्यक हैं और टीए प्रोटीन को सही झिल्ली में मार्गदर्शन करने के लिए पर्याप्त हैं29. एक परिभाषित अनुक्रम आकृति के बजाय जैव भौतिक विशेषताओं की मान्यता लक्ष्यीकरण मार्गों की निष्ठा को सीमित करती है5. इस प्रकार, टीए प्रोटीन का गलतीकरण प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क के लिए एक आम तनाव है। सेलुलर तनाव, जैसे कि जीईएफ मार्ग का अवरोध, ओएमएम और माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन में प्रोटीन गलतता का कारण बनता है जब तक कि इन प्रोटीनों को तुरंत30, 31नहीं हटा दियाजाताहै।
झिल्ली प्रोटेओस्टेसिस में एक आम विषय एएए +(एकटीपीए ए सेलुलर एस्टिटिव्स के साथ सोसित) प्रोटीन का उपयोग लिपिड बाइलेयर1, 32, 33, 34,35,36,37, 38 से पुराने, क्षतिग्रस्तयागलत प्रोटीन को हटाने के लिए है। . एएए + प्रोटीन आणविक मोटर्स हैं जो हेक्सामेरिक रिंग बनाते हैं और एक सब्सट्रेट को फिर से तैयार करने के लिए एटीपी निर्भर आंदोलनों से गुजरते हैं, अक्सर एक संकीर्ण अक्षीयपोर 39,40के माध्यम से स्थानांतरण द्वारा। यद्यपि एएए + एटीपैस द्वारा झिल्ली प्रोटीन के निष्कर्षण का अध्ययन करने के लिए बहुत प्रयास समर्पित किया गया है, पुनर्गठन जटिल हैं या लिपिड और डिटर्जेंट41, 42का मिश्रण शामिल हैं, जो लिपिड बाइलेयर से सब्सट्रेट निष्कर्षण के तंत्र की जांच करने के लिए प्रयोगात्मक शक्ति को सीमित करता है।
एमएसपी1 ओएमएम और पेरोक्सीसोम्स में लंगर डाले जाने वाला एक अत्यधिक संरक्षित एएए + एटीपैस है जो गलत ता प्रोटीन43 , 44, 45 ,46,47को हटाकर झिल्ली प्रोटेओस्टेसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एमएसपी1 को हाल ही में ओएमएम48में स्थानांतरण के दौरान स्टाल करने वाले झिल्ली प्रोटीन को हटाकर माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन आयात तनाव को कम करने के लिए भी दिखाया गया था । एमएसपी1 या मानव समरूप ATAD1 के परिणामस्वरूप माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन, ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन में विफलता, दौरे, स्ट्रोक के बाद चोट बढ़ जाती है, और प्रारंभिक मृत्यु31,49,50,51,52,53, 54,55, 56, 56होती है।
हमने दिखाया है कि Msp1 के साथ टीए प्रोटीन का सह-पुनर्गठन करना और लिपिड बाइलेयर57से निष्कर्षण का पता लगाना संभव है। यह सरलीकृत प्रणाली पूरी तरह से शुद्ध प्रोटीन का उपयोग परिभाषित लिपोसोम में पुनर्गठित करती है जो ओएमएम(चित्र 1)58,59की नकल करती है । प्रायोगिक नियंत्रण का यह स्तर सब्सट्रेट निष्कर्षण के विस्तृत मशीनी प्रश्नों को संबोधित कर सकता है जो अन्य एएए + प्रोटीन से जुड़े अधिक जटिल पुनर्संस्थाओं के साथ प्रायोगिक रूप से असभ्य हैं। यहां, हम लिपिसोम तैयारी, झिल्ली प्रोटीन पुनर्गठन, और निष्कर्षण परख के लिए हमारे तरीकों का ब्यौरा प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । हमारी आशा है कि इन प्रायोगिक विवरणों से झिल्ली प्रोटेओस्टेसिस की आवश्यक लेकिन खराब समझी जाने वाली प्रक्रिया का और अध्ययन करने में मदद मिलेगी ।
Protocol
Representative Results
Discussion
उचित माइटोकॉन्ड्रियल कार्य एक मजबूत प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण प्रणाली पर निर्भर करता है। टीए प्रोटीन लक्ष्यीकरण रास्तों की निष्ठा में अंतर्निहित सीमाओं के कारण, मिसमोकलाइज्ड टीए प्रोटीन माइटोकॉन…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एमएलडब्ल्यू ने शिकागो विश्वविद्यालय में डॉ रॉबर्ट कीनन के साथ अपने पोस्टडॉक्टोरल अध्ययन के दौरान इस प्रोटोकॉल का हिस्सा विकसित किया।
यह काम एनआईएच ग्रांट 1R35GM137904-01 द्वारा एमएलडब्ल्यू को वित्त पोषित किया जाता है ।
Materials
| Biobeads | Bio-Rad | 1523920 | |
| Bovine liver phosphatidyl inositol | Avanti | 840042C | PI |
| Chicken egg phosphatidyl choline | Avanti | 840051C | PC |
| Chicken egg phosphatidyl ethanolamine | Avanti | 840021C | PE |
| ECL Select western blotting detection reagent | GE | RPN2235 | |
| Filter supports | Avanti | 610014 | |
| Glass vial | VWR | 60910L-1 | |
| Glutathione spin column | Thermo Fisher | PI16103 | |
| Goat anti-rabbit | Thermo Fisher | NC1050917 | |
| Mini-Extruder | Avanti | 610020 | |
| Polycarbonate membrane | Avanti | 610006 | 200 nM |
| PVDF membrane | Thermo Fisher | 88518 | 45 µM |
| Rabbit anti-FLAG | Sigma-Aldrich | F7245 | |
| Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti | 840035C | DOPS |
| Synthetic 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol | Avanti | 710335C | TOCL |
| Syringe, 1 mL | Norm-Ject | 53548-001 | |
| Syringe, 1 mL, gas-tight | Avanti | 610017 |
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