Восстановление экстракции Msp1 с полностью очищенными компонентами
Summary
Здесь мы представляем подробный протокол восстановления экстракционной активности Msp1 с полностью очищенными компонентами в определенных протеолипосомах.
Abstract
Являясь центром окислительного фосфорилирования и апоптотической регуляции, митохондрии играют жизненно важную роль в здоровье человека. Правильная функция митохондрий зависит от надежной системы контроля качества для поддержания белкового гомеостаза (протеостаза). Снижение митохондриального протеостаза было связано с раком, старением, нейродегенерацией и многими другими заболеваниями. Msp1 представляет собой АТФазу AAA+, закрепленную во внешней митохондриальной мембране, которая поддерживает протеостаз путем удаления неправильно локализованных хвостовых белков. Используя очищенные компоненты, преобразованные в протеолипосомы, мы показали, что Msp1 необходим и достаточен для извлечения модельного хвостового белка из липидного бислоя. Наша упрощенная восстановленная система преодолевает несколько технических барьеров, которые препятствовали детальному изучению экстракции мембранного белка. Здесь мы предоставляем подробные методы генерации липосом, восстановления мембранного белка и экстракционного анализа Msp1.
Introduction
Правильная клеточная функция зависит от процесса, называемого протеостазом, который гарантирует, что функциональные белки находятся в правильной концентрации и клеточном расположении1. Сбои в протеостазе приводят к нарушению функции органелл и связаны со многими нейродегенеративными заболеваниями2,3,4. Мембранные белки представляют собой уникальные проблемы для сети протеостаза, поскольку они должны быть нацелены на правильную мембрану, избегая при этом агрегации из гидрофобных трансмембранных доменов (TMD)5. Следовательно, специализированные механизмы эволюционировали, чтобы защитить гидрофобную ВНЧС от цитозоля и облегчить нацеливание и введение в правильную клеточную мембрану6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Митохондрии являются метаболическим центром клетки и участвуют в многочисленных важных клеточных процессах, таких как: окислительное фосфорилирование, генерация железо-серного кластера и апоптотическая регуляция16,17. Эти эндосимбиотические органеллы содержат две мембраны, называемые внутренней митохондриальной мембраной (IMM) и внешней митохондриальной мембраной (OMM). Более 99% из 1 500 митохондриальных белков человека кодируются в ядерном геноме и должны быть перемещены через одну или две различные мембраны18,19. Таким образом, правильная функция митохондрий зависит от надежной сети протеостаза для исправления любых ошибок в нацеливании на белок или транслокации.
Наша лаборатория фокусируется на подмножестве белков митохондриальной мембраны, называемых белками хвостового якоря (TA), которые имеют один трансмембранный домен на самом С-конце20,21,22,23,24. Белки TA участвуют в ряде важных процессов, таких как апоптоз, транспорт пузырьков и транслокация белка25. Уникальная топология белков ТА требует посттрансляционной вставки, которая происходит в эндоплазматическом ретикулуме (ER) по направляющему входу хвостового якорного (GET) или эндоплазматического ретикулярного мембранного белкового комплекса (EMC) или в ОММ по плохо охарактеризованному пути20,26,27,28. Биофизические свойства ВНЧС необходимы и достаточны для направления белков ТА к правильной мембране29. Распознавание биофизических характеристик, а не определенного мотива последовательности, ограничивает точность путей нацеливания5. Таким образом, неправильная локализация белков ТА является общим стрессом для сетей протеостаза. Клеточный стресс, такой как ингибирование пути GET, вызывает увеличение неправильной локализации белка к ОММ и митохондриальную дисфункцию, если эти белки не будут быстро удалены30,31.
Общей темой в мембранном протеостазе является использование белков AAA+(ATPase A,ссоциированная с клеточными активами A)для удаления старых, поврежденных или неправильно локализованных белков из липидного бислоя1,32,33,34,35,36,37,38 . Белки AAA+ представляют собой молекулярные двигатели, которые образуют гексамерные кольца и подвергаются АТФ-зависимым движениям для ремоделирования субстрата, часто путем транслокации через узкую осевую пору39,40. Хотя большие усилия были посвящены изучению экстракции мембранных белков AAA+ ATPases, реконструкции являются сложными или включают смесь липидов и моющего средства41,42,что ограничивает экспериментальную способность исследовать механизм экстракции субстрата из липидного бислоя.
Msp1 представляет собой высококонсервативную ААА+ АТФазу, закрепленную в ОММ и пероксисомах, которая играет решающую роль в мембранном протеостазе путем удаления неправильно локализованных белков ТА43,44,45,46,47. Недавно было также показано, что Msp1 облегчает стресс импорта митохондриальных белков путем удаления мембранных белков, которые останавливаются во время транслокации через OMM48. Потеря Msp1 или человеческого гомолога ATAD1 приводит к фрагментации митохондрий, сбоям в окислительном фосфорилировании, судорогам, увеличению травматизма после инсульта и ранней смерти31,49,50,51,52,53,54,55,56.
Мы показали, что можно совместно воссоздать белки ТА с Msp1 и обнаружить экстракцию из липидного бислоя57. Эта упрощенная система использует полностью очищенные белки, преобразованные в определенные липосомы, которые имитируют OMM(Рисунок 1)58,59. Этот уровень экспериментального контроля может решить подробные механистические вопросы экстракции субстрата, которые экспериментально трудноразрешимы с более сложными восстановлениями с участием других белков AAA+. Здесь мы предоставляем экспериментальные протоколы, подробно описывающие наши методы получения липосом, восстановления мембранного белка и экстракционного анализа. Мы надеемся, что эти экспериментальные детали облегчат дальнейшее изучение существенного, но плохо изученного процесса мембранного протеостаза.
Protocol
Representative Results
Discussion
Правильная функция митохондрий зависит от надежной системы контроля качества белка. Из-за присущих ограничений в точности путей таргетирования белка TA, неправильно локализованные белки TA являются постоянным источником стресса для митохондрий. Ключевым компонентом сети митохондриал…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MLW разработал часть этого протокола во время своих постдокторских исследований с доктором Робертом Кинаном в Чикагском университете.
Эта работа финансируется грантом NIH 1R35GM137904-01 для MLW.
Materials
| Biobeads | Bio-Rad | 1523920 | |
| Bovine liver phosphatidyl inositol | Avanti | 840042C | PI |
| Chicken egg phosphatidyl choline | Avanti | 840051C | PC |
| Chicken egg phosphatidyl ethanolamine | Avanti | 840021C | PE |
| ECL Select western blotting detection reagent | GE | RPN2235 | |
| Filter supports | Avanti | 610014 | |
| Glass vial | VWR | 60910L-1 | |
| Glutathione spin column | Thermo Fisher | PI16103 | |
| Goat anti-rabbit | Thermo Fisher | NC1050917 | |
| Mini-Extruder | Avanti | 610020 | |
| Polycarbonate membrane | Avanti | 610006 | 200 nM |
| PVDF membrane | Thermo Fisher | 88518 | 45 µM |
| Rabbit anti-FLAG | Sigma-Aldrich | F7245 | |
| Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti | 840035C | DOPS |
| Synthetic 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol | Avanti | 710335C | TOCL |
| Syringe, 1 mL | Norm-Ject | 53548-001 | |
| Syringe, 1 mL, gas-tight | Avanti | 610017 |
Riferimenti
- Song, J., Herrmann, J. M., Becker, T. Quality control of the mitochondrial proteome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22, 54-70 (2021).
- Phillips, B. P., Miller, E. A. Membrane protein folding and quality control. Current Opinion in Structural Biology. 69, 50-54 (2021).
- Jiang, H. Quality control pathways of tail-anchored proteins. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1868, 118922 (2020).
- McKenna, M. J., et al. The endoplasmic reticulum P5A-ATPase is a transmembrane helix dislocase. Science. 369, (2020).
- Hegde, R. S., Zavodszky, E. Recognition and Degradation of Mislocalized Proteins in Health and Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11, 033902 (2019).
- Shao, S., Hegde, R. S. A calmodulin-dependent translocation pathway for small secretory proteins. Cell. 147, 1576-1588 (2011).
- Samuelson, J. C., et al. YidC mediates membrane protein insertion in bacteria. Nature. 406, 637-641 (2000).
- Anghel, S. A., McGilvray, P. T., Hegde, R. S., Keenan, R. J. Identification of Oxa1 Homologs Operating in the Eukaryotic Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21, 3708-3716 (2017).
- Aviram, N., et al. The SND proteins constitute an alternative targeting route to the endoplasmic reticulum. Nature. 540, 134-138 (2016).
- Voorhees, R. M., Hegde, R. S. Structure of the Sec61 channel opened by a signal sequence. Science. 351, 88-91 (2016).
- Cichocki, B. A., Krumpe, K., Vitali, D. G., Rapaport, D. Pex19 is involved in importing dually targeted tail-anchored proteins to both mitochondria and peroxisomes. Traffic. 19, 770-785 (2018).
- Mateja, A., et al. Protein targeting. Structure of the Get3 targeting factor in complex with its membrane protein cargo. Science. 347, 1152-1155 (2015).
- Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138, 628-644 (2009).
- Chitwood, P. J., Hegde, R. S. An intramembrane chaperone complex facilitates membrane protein biogenesis. Nature. , (2020).
- Chitwood, P. J., Juszkiewicz, S., Guna, A., Shao, S., Hegde, R. S. EMC Is Required to Initiate Accurate Membrane Protein Topogenesis. Cell. 175, 1-30 (2018).
- Bock, F. J., Tait, S. W. G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21, 85-100 (2020).
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, (2019).
- Bykov, Y. S., Rapaport, D., Herrmann, J. M., Schuldiner, M. Cytosolic Events in the Biogenesis of Mitochondrial Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 45, 650-667 (2020).
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 427, 1135 (2019).
- Borgese, N., Coy-Vergara, J., Colombo, S. F., Schwappach, B. The Ways of Tails: the GET Pathway and more. The Protein Journal. , 1-17 (2019).
- Mateja, A., Keenan, R. J. A structural perspective on tail-anchored protein biogenesis by the GET pathway. Current Opinion in Structural Biology. 51, 195-202 (2018).
- Chio, U. S., Cho, H., Shan, S. Mechanisms of Tail-Anchored Membrane Protein Targeting and Insertion. Annual review of cell and developmental biology. 33, 417-438 (2017).
- Denic, V. A portrait of the GET pathway as a surprisingly complicated young man. Trends in biochemical sciences. , (2012).
- Hegde, R. S., Keenan, R. J. Tail-anchored membrane protein insertion into the endoplasmic reticulum. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12, 787-798 (2011).
- Kalbfleisch, T., Cambon, A., Wattenberg, B. W. A bioinformatics approach to identifying tail-anchored proteins in the human genome. Traffic. 8, 1687-1694 (2007).
- Doan, K. N., et al. The Mitochondrial Import Complex MIM Functions as Main Translocase for α-Helical Outer Membrane Proteins. Cell Reports. 31, (2020).
- McDowell, M. A., et al. Structural Basis of Tail-Anchored Membrane Protein Biogenesis by the GET Insertase Complex. Molecular Cell. 80, (2020).
- Guna, A., Volkmar, N., Christianson, J. C., Hegde, R. S. The ER membrane protein complex is a transmembrane domain insertase. Science. 591, 3099 (2017).
- Rao, M., et al. Multiple selection filters ensure accurate tail-anchored membrane protein targeting. eLife. 5, 21301 (2016).
- Schuldiner, M., et al. The GET complex mediates insertion of tail-anchored proteins into the ER membrane. Cell. 134, 634-645 (2008).
- Chen, Y. -. C., et al. Msp1/ATAD1 maintains mitochondrial function by facilitating the degradation of mislocalized tail-anchored proteins. The EMBO journal. 33, 1548-1564 (2014).
- Wu, X., Rapoport, T. A. Translocation of Proteins through a Distorted Lipid Bilayer. Trends in Cell Biology. , (2021).
- Phillips, B. P., Gomez-Navarro, N., Miller, E. A. Protein quality control in the endoplasmic reticulum. Current Opinion in Cell Biology. 65, 96-102 (2020).
- van de Weijer, M. L., et al. Quality Control of ER Membrane Proteins by the RNF185/Membralin Ubiquitin Ligase Complex. Molecular Cell. 79, (2020).
- Weir, N. R., Kamber, R. A., Martenson, J. S., Denic, V. The AAA protein Msp1 mediates clearance of excess tail-anchored proteins from the peroxisomal membrane. eLife. 6, 28507 (2017).
- Gardner, B. M., et al. The peroxisomal AAA-ATPase Pex1/Pex6 unfolds substrates by processive threading. Nature communications. 9, 135 (2018).
- Puchades, C., et al. Unique Structural Features of the Mitochondrial AAA+ Protease AFG3L2 Reveal the Molecular Basis for Activity in Health and Disease. Molecular Cell. , (2019).
- Castanzo, D. T., LaFrance, B., Martin, A. The AAA+ ATPase Msp1 is a processive protein translocase with robust unfoldase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 14970-14977 (2020).
- Wang, L., Myasnikov, A., Pan, X., Walter, P. Structure of the AAA protein Msp1 reveals mechanism of mislocalized membrane protein extraction. eLife. 9, (2020).
- Puchades, C., Sandate, C. R., Lander, G. C. The molecular principles governing the activity and functional diversity of AAA+ proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , 1-16 (2019).
- Yang, Y., et al. Folding-Degradation Relationship of a Membrane Protein Mediated by the Universally Conserved ATP-Dependent Protease FtsH. Journal of the American Chemical Society. , 10 (2018).
- Baldridge, R. D., Rapoport, T. A. Autoubiquitination of the Hrd1 Ligase Triggers Protein Retrotranslocation in ERAD. Cell. 166, 394-407 (2016).
- Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Sorting out how Msp1 maintains mitochondrial membrane proteostasis. Mitochondrion. 49, 128-134 (2019).
- Wang, L., Walter, P. Msp1/ATAD1 in Protein Quality Control and Regulation of Synaptic Activities. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 1-24 (2020).
- Dederer, V., et al. Cooperation of mitochondrial and ER factors in quality control of tail-anchored proteins. eLife. 8, 1126 (2019).
- Matsumoto, S., et al. Msp1 Clears Mistargeted Proteins by Facilitating Their Transfer from Mitochondria to the ER. Molecular Cell. , (2019).
- Li, L., Zheng, J., Wu, X., Jiang, H. Mitochondrial AAA-ATPase Msp1 detects mislocalized tail-anchored proteins through a dual-recognition mechanism. EMBO Reports. 20, (2019).
- Weidberg, H., Amon, A. MitoCPR – a surveillance pathway that protects mitochondria in response to protein import stress. Science. 360, (2018).
- Okreglak, V., Walter, P. The conserved AAA-ATPase Msp1 confers organelle specificity to tail-anchored proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (2014).
- Piard, J., et al. A homozygous ATAD1 mutation impairs postsynaptic AMPA receptor trafficking and causes a lethal encephalopathy. Brain. , (2018).
- Zhang, J., et al. The AAA+ ATPase Thorase regulates AMPA receptor-dependent synaptic plasticity and behavior. Cell. 145, 284-299 (2011).
- Prendergast, J., et al. Ganglioside regulation of AMPA receptor trafficking. The Journal of Neuroscience. 34, 13246-13258 (2014).
- Umanah, G. K. E., et al. Thorase variants are associated with defects in glutamatergic neurotransmission that can be rescued by Perampanel. Science Translational Medicine. 9, 4985 (2017).
- Pignatelli, M., et al. Synaptic Plasticity onto Dopamine Neurons Shapes Fear Learning. Neuron. 93, 425-440 (2017).
- Zhang, J., et al. The AAA Thorase is neuroprotective against ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , 271678 (2018).
- Umanah, G. K. E., et al. AMPA Receptor Surface Expression Is Regulated by S-Nitrosylation of Thorase and Transnitrosylation of NSF. Cell Reports. 33, 108329 (2020).
- Wohlever, M. L., Mateja, A., McGilvray, P. T., Day, K. J., Keenan, R. J. Msp1 Is a Membrane Protein Dislocase for Tail-Anchored Proteins. Molecular Cell. 67, 194-202 (2017).
- Lovell, J. F., et al. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cell. 135, 1074-1084 (2008).
- Leshchiner, E. S., Braun, C. R., Bird, G. H., Walensky, L. D. Direct activation of full-length proapoptotic BAK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 986-995 (2013).
