Reconstitución de la actividad de extracción de Msp1 con componentes totalmente purificados

Summary

Aquí, presentamos un protocolo detallado para la reconstitución de la actividad de extracción de Msp1 con componentes totalmente purificados en proteoliposomas definidos.

Abstract

Como centro de fosforilación oxidativa y regulación apoptótica, las mitocondrias desempeñan un papel vital en la salud humana. La función mitocondrial adecuada depende de un sistema de control de calidad robusto para mantener la homeostasis de proteínas (proteostasis). Las disminuciones en la proteostasis mitocondrial se han relacionado con el cáncer, el envejecimiento, la neurodegeneración y muchas otras enfermedades. Msp1 es una AAA+ ATPasa anclada en la membrana mitocondrial externa que mantiene la proteostasis mediante la eliminación de proteínas mal localizadas ancladas en la cola. Utilizando componentes purificados reconstituidos en proteoliposomas, hemos demostrado que Msp1 es necesario y suficiente para extraer una proteína modelo anclada a la cola de una bicapa lipídica. Nuestro sistema reconstituido simplificado supera varias de las barreras técnicas que han obstaculizado el estudio detallado de la extracción de proteínas de membrana. Aquí, proporcionamos métodos detallados para la generación de liposomas, la reconstitución de proteínas de membrana y el ensayo de extracción Msp1.

Introduction

La función celular adecuada depende de un proceso llamado proteostasis, que asegura que las proteínas funcionales estén en la concentración y ubicación celular^{correctas 1}. Las fallas en la proteostasis conducen a una función orgánulo comprometida y se asocian con muchas enfermedades neurodegenerativas^2,3,4. Las proteínas de membrana presentan desafíos únicos para la red de proteostasis, ya que deben dirigirse a la membrana correcta, evitando al mismo tiempo la agregación de los dominios transmembrana hidrofóbicos (TMD)⁵. En consecuencia, la maquinaria especializada ha evolucionado para proteger el TMD hidrofóbico del citosol y facilitar la orientación y la inserción en la membrana celular adecuada^{6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.}

Las mitocondrias son el centro metabólico de la célula y están involucradas en numerosos procesos celulares esenciales como: fosforilación oxidativa, generación de cúmulos de hierro-azufre y regulación apoptótica^16,17. Estos orgánulos endosimbióticos contienen dos membranas, conocidas como la membrana mitocondrial interna (IMM) y la membrana mitocondrial externa (OMM). Más del 99% de las 1.500 proteínas mitocondriales humanas están codificadas en el genoma nuclear y necesitan ser translocadas a través de una o dos membranas diferentes^18,19. Por lo tanto, la función mitocondrial adecuada depende de una red de proteostasis robusta para corregir cualquier error en la orientación o translocación de proteínas.

Nuestro laboratorio se centra en un subconjunto de proteínas de membrana mitocondrial llamadas proteínas ancladas en la cola (TA), que tienen un solo dominio transmembrana en el extremo C^{20,21,22,23,24}. Las proteínas TA están involucradas en una serie de procesos esenciales, como la apoptosis, el transporte de vesículas y la translocación de proteínas²⁵. La topología única de las proteínas TA requiere la inserción post-traduccional, que ocurre en el retículo endoplásmico (ER) por la entrada guiada de las vías del complejo proteico de membrana (EMC) anclada en la cola (GET) o en el retículo endoplásmico (EMC) o en el OMM por una vía mal caracterizada^20,26,27,28. Las propiedades biofísicas del TMD son necesarias y suficientes para guiar las proteínas TA a la membrana correcta²⁹. El reconocimiento de características biofísicas en lugar de un motivo de secuencia definido limita la fidelidad de las vías de orientación⁵. Por lo tanto, la localización errónea de las proteínas TA es un estrés común para las redes de proteostasis. El estrés celular, como la inhibición de la vía GET, causa un aumento en la mala localización de proteínas a la OMM y disfunción mitocondrial a menos que estas proteínas se eliminen rápidamente^30,31.

Un tema común en la proteostasis de membrana es el uso de proteínas AAA+(ATPasa Associada con calidades Acelulares) para eliminar proteínas viejas, dañadas o mal localizadas de la bicapa lipídica^{1,32,33,34,35,36,37,38} . Las proteínas AAA+ son motores moleculares que forman anillos hexaméricos y sufren movimientos dependientes de ATP para remodelar un sustrato, a menudo por translocación a través de un estrecho poro axial^39,40. Aunque se ha dedicado un gran esfuerzo a estudiar la extracción de proteínas de membrana por AAA+ ATPasas, las reconstituciones son complejas o implican una mezcla de lípidos y detergente^41,42,lo que limita el poder experimental para examinar el mecanismo de extracción del sustrato a partir de la bicapa lipídica.

Msp1 es una AAA+ ATPasa altamente conservada anclada en la OMM y los peroxisomas que desempeña un papel crítico en la proteostasis de membrana al eliminar las proteínas TA mal localizadas^{43,44,45,46,47.} Msp1 también se demostró recientemente que alivia el estrés de importación de proteínas mitocondriales al eliminar las proteínas de membrana que se estancan durante la translocación a través de la OMM^48. La pérdida de Msp1 o el homólogo humano ATAD1 resulta en fragmentación mitocondrial, fallas en la fosforilación oxidativa, convulsiones, aumento de lesiones después de un accidente cerebrovascular y muerte prematura^{31,49,50,51,52,53,54,55,56}.

Hemos demostrado que es posible co-reconstituir proteínas TA con Msp1 y detectar la extracción de la bicapa lipídica^57. Este sistema simplificado utiliza proteínas totalmente purificadas reconstituidas en liposomas definidos que imitan el OMM(Figura 1)^58,59. Este nivel de control experimental puede abordar cuestiones mecanicistas detalladas de extracción de sustrato que son experimentalmente intratables con reconstituciones más complejas que involucran otras proteínas AAA +. Aquí, proporcionamos protocolos experimentales que detallan nuestros métodos para la preparación de liposomas, la reconstitución de proteínas de membrana y el ensayo de extracción. Esperamos que estos detalles experimentales faciliten un mayor estudio del proceso esencial pero poco comprendido de la proteostasis de la membrana.

Protocol

1. Preparación de liposomas Combine las reservas de cloroformo de lípidos en proporciones apropiadas para imitar la membrana mitocondrial externa. Preparar 25 mg de mezcla lipídica. Utilizamos una mezcla previamente establecida de lípidos que imitan las membranas mitocondriales, que consiste en una proporción molar de 48:28:10:10:4 de fosfatidilcolina de huevo de gallina (PC), fosfatidiletanolamina (PE) de huevo de gallina, fosfatidil inositol hepático bovino (PI), sintético 1,2-dioleoil-sn-glice…

Representative Results

Para interpretar correctamente los resultados, el gel libre de manchas y la mancha occidental deben verse juntos. El gel sin manchas garantiza una carga igual en todas las muestras. Al ver el gel libre de manchas, las chaperonas (GST-calmodulin y GST-SGTA) serán visibles en los carriles INPUT (I) y ELUTE (E). Verifique que la intensidad de estas bandas sea uniforme en todas las muestras input. Del mismo modo, asegúrese de que la intensidad sea uniforme en todas las muestras eluticas. El ELUTE es 5 veces más concentrad…

Discussion

La función mitocondrial adecuada depende de un sistema robusto de control de calidad de proteínas. Debido a los límites inherentes en la fidelidad de las vías de orientación de la proteína TA, las proteínas TA mal localizadas son una fuente constante de estrés para las mitocondrias. Un componente clave de la red de proteostasis mitocondrial es Msp1, que es una AAA+ ATPasa anclada a la membrana que elimina las proteínas TA mal localizadas de la OMM. Aquí, hemos descrito cómo preparar proteoliposomas, co-reconst…

Materials

Biobeads	Bio-Rad	1523920
Bovine liver phosphatidyl inositol	Avanti	840042C	PI
Chicken egg phosphatidyl choline	Avanti	840051C	PC
Chicken egg phosphatidyl ethanolamine	Avanti	840021C	PE
ECL Select western blotting detection reagent	GE	RPN2235
Filter supports	Avanti	610014
Glass vial	VWR	60910L-1
Glutathione spin column	Thermo Fisher	PI16103
Goat anti-rabbit	Thermo Fisher	NC1050917
Mini-Extruder	Avanti	610020
Polycarbonate membrane	Avanti	610006	200 nM
PVDF membrane	Thermo Fisher	88518	45 µM
Rabbit anti-FLAG	Sigma-Aldrich	F7245
Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine	Avanti	840035C	DOPS
Synthetic 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol	Avanti	710335C	TOCL
Syringe, 1 mL	Norm-Ject	53548-001
Syringe, 1 mL, gas-tight	Avanti	610017