Rekonstitution av Msp1-extraktionsaktivitet med helt renade komponenter
Summary
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för rekonstitution av Msp1 extraktion verksamhet med helt renade komponenter i definierade proteoliposomer.
Abstract
Som centrum för oxidativ fosforylering och apokatisk reglering spelar mitokondrier en viktig roll för människors hälsa. Korrekt mitokondriell funktion beror på ett robust kvalitetskontrollsystem för att upprätthålla proteinhomeostas (proteostas). Nedgångar i mitokondriell proteostas har kopplats till cancer, åldrande, neurodegeneration och många andra sjukdomar. Msp1 är en AAA + ATPase förankrad i det yttre mitokondriella membranet som upprätthåller proteostas genom att ta bort fellokaliserade svansförankrade proteiner. Med hjälp av renade komponenter rekonstituerade till proteoliposomer har vi visat att Msp1 är nödvändigt och tillräckligt för att extrahera ett modell svansförankrat protein från en lipidbilayer. Vårt förenklade rekonstituerade system övervinner flera av de tekniska hinder som har hindrat detaljerad studie av membranproteinutvinning. Här tillhandahåller vi detaljerade metoder för generering av liposomer, membranproteinrekonstitution och Msp1 extraktionsanalys.
Introduction
Korrekt cellulär funktion beror på en process som kallas proteostas, vilket säkerställer att funktionella proteiner är vid rätt koncentration och cellulär plats1. Misslyckanden i proteostas leder till komprometterad organellfunktion och är associerade med många neurodegenerativa sjukdomar2,3,4. Membranproteiner innebär unika utmaningar för proteostasnätverket eftersom de måste riktas mot rätt membran samtidigt som aggregering undviks från de hydrofoba transmembrandomänerna (TMDs)5. Följaktligen har specialiserade maskiner utvecklats för att skydda den hydrofoba TMD från cytosolen och underlätta inriktning och införande i rätt cellmembran6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Mitokondrier är cellens metaboliska nav och är involverade i många viktiga cellulära processer som: oxidativ fosforylering, järn-svavelklustergenerering och apokatotisk reglering16,17. Dessa endosymbiotiska organeller innehåller två membran, så kallade inre mitokondriella membran (IMM) och det yttre mitokondriella membranet (OMM). Över 99% av de 1 500 mänskliga mitokondriella proteinerna är kodade i kärngenomet och måste omplaceras över ett eller två olika membran18,19. Korrekt mitokondriell funktion beror således på ett robust proteosasnätverk för att korrigera eventuella fel i proteininriktning eller flyttning.
Vårt labb fokuserar på en delmängd av mitokondriella membranproteiner som kallas tail-anchored (TA) proteiner, som har en enda transmembran domän vid mycket C-terminus20,21,22,23,24. TA-proteiner är involverade i ett antal väsentliga processer, såsom apoptos, blåsbandstransport och proteinflyttning25. Den unika topologin hos TA-proteiner kräver post-translationell insättning, som förekommer i endoplasmiskt retikulum (ER) genom guidad ingång av tail-förankrad (GET) eller endoplasmiskt retikulummembranproteinkomplex (EMC) eller in i OMM av en dåligt karakteriserad väg20,26,27,28. De biofysiska egenskaperna hos TMD är nödvändiga och tillräckliga för att styra TA-proteiner till rätt membran29. Erkännandet av biofysiska egenskaper snarare än ett definierat sekvensmotiv begränsar troheten hos inriktningsvägarna5. Således är mislocalization av TA-proteiner en vanlig stress för proteostasnätverken. Cellulär stress, såsom hämning av GET-vägen, orsakar en ökning av protein mislocalization till OMM och mitokondriell dysfunktion om inte dessa proteiner omedelbart avlägsnas30,31.
Ett vanligt tema i membranprotetas är användningen av AAA+(ATPase Associated with cellular Activities) proteiner för att ta bort gamla, skadade eller fellokaliserade proteiner från lipidbilayer1,32,33,34,35,36,37,38 . AAA+ proteiner är molekylära motorer som bildar hexameriska ringar och genomgår ATP-beroende rörelser för att omforma ett substrat, ofta genom flyttning genom en smal axiell por39,40. Även om stor ansträngning har ägnats åt att studera extraktion av membranproteiner av AAA + ATPases, är rekonstitutionerna komplexa eller involverar en blandning av lipider och tvättmedel41,42, vilket begränsar den experimentella kraften att undersöka mekanismen för substratuttag från lipidbilayer.
Msp1 är en mycket bevarad AAA + ATPase förankrad i OMM och peroxisomer som spelar en kritisk roll i membranprotetas genom att ta bort fellokaliserade TA-proteiner43,44,45,46,47. Msp1 visade sig också nyligen lindra mitokondriell proteinimportstress genom att ta bort membranproteiner som stannar under flyttning över OMM48. Förlust av Msp1 eller den mänskliga homologen ATAD1 resulterar i mitokondriell fragmentering, misslyckanden i oxidativ fosforylering, anfall, ökad skada efter stroke och tidig död31,49,50,51,52,53,54,55,56.
Vi har visat att det är möjligt att samrekonstituera TA-proteiner med Msp1 och upptäcka extraktionen från lipidbilayer57. Detta förenklade system använder helt renade proteiner som rekonstituerats till definierade liposomer som efterliknar OMM (figur 1)58,59. Denna nivå av experimentell kontroll kan ta itu med detaljerade mekanistiska frågor om substrat extraktion som är experimentellt svårbehandlade med mer komplexa rekonstitutioner som involverar andra AAA + proteiner. Här tillhandahåller vi experimentella protokoll som beskriver våra metoder för liposomberedning, membranproteinrekonstitution och extraktionsanalysen. Det är vår förhoppning att dessa experimentella detaljer kommer att underlätta ytterligare studier av den väsentliga men dåligt förstådda processen av membranprotetas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Korrekt mitokondriell funktion beror på ett robust proteinkvalitetskontrollsystem. På grund av inneboende gränser i troheten hos TA-proteinets inriktningsvägar är fellokaliserade TA-proteiner en konstant källa till stress för mitokondrier. En viktig komponent i mitokondriell proteostas nätverk är Msp1, som är ett membran förankrat AAA + ATPase som tar bort mislocalized TA proteiner från OMM. Här har vi beskrivit hur man förbereder proteoliposomer, co-reconstitute Msp1 och en modell TA protein, och utföra e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MLW utvecklade en del av detta protokoll under sina postdoktorala studier med Dr. Robert Keenan vid University of Chicago.
Detta arbete finansieras av NIH-anslag 1R35GM137904-01 till MLW.
Materials
| Biobeads | Bio-Rad | 1523920 | |
| Bovine liver phosphatidyl inositol | Avanti | 840042C | PI |
| Chicken egg phosphatidyl choline | Avanti | 840051C | PC |
| Chicken egg phosphatidyl ethanolamine | Avanti | 840021C | PE |
| ECL Select western blotting detection reagent | GE | RPN2235 | |
| Filter supports | Avanti | 610014 | |
| Glass vial | VWR | 60910L-1 | |
| Glutathione spin column | Thermo Fisher | PI16103 | |
| Goat anti-rabbit | Thermo Fisher | NC1050917 | |
| Mini-Extruder | Avanti | 610020 | |
| Polycarbonate membrane | Avanti | 610006 | 200 nM |
| PVDF membrane | Thermo Fisher | 88518 | 45 µM |
| Rabbit anti-FLAG | Sigma-Aldrich | F7245 | |
| Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti | 840035C | DOPS |
| Synthetic 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol | Avanti | 710335C | TOCL |
| Syringe, 1 mL | Norm-Ject | 53548-001 | |
| Syringe, 1 mL, gas-tight | Avanti | 610017 |
Riferimenti
- Song, J., Herrmann, J. M., Becker, T. Quality control of the mitochondrial proteome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22, 54-70 (2021).
- Phillips, B. P., Miller, E. A. Membrane protein folding and quality control. Current Opinion in Structural Biology. 69, 50-54 (2021).
- Jiang, H. Quality control pathways of tail-anchored proteins. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1868, 118922 (2020).
- McKenna, M. J., et al. The endoplasmic reticulum P5A-ATPase is a transmembrane helix dislocase. Science. 369, (2020).
- Hegde, R. S., Zavodszky, E. Recognition and Degradation of Mislocalized Proteins in Health and Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11, 033902 (2019).
- Shao, S., Hegde, R. S. A calmodulin-dependent translocation pathway for small secretory proteins. Cell. 147, 1576-1588 (2011).
- Samuelson, J. C., et al. YidC mediates membrane protein insertion in bacteria. Nature. 406, 637-641 (2000).
- Anghel, S. A., McGilvray, P. T., Hegde, R. S., Keenan, R. J. Identification of Oxa1 Homologs Operating in the Eukaryotic Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21, 3708-3716 (2017).
- Aviram, N., et al. The SND proteins constitute an alternative targeting route to the endoplasmic reticulum. Nature. 540, 134-138 (2016).
- Voorhees, R. M., Hegde, R. S. Structure of the Sec61 channel opened by a signal sequence. Science. 351, 88-91 (2016).
- Cichocki, B. A., Krumpe, K., Vitali, D. G., Rapaport, D. Pex19 is involved in importing dually targeted tail-anchored proteins to both mitochondria and peroxisomes. Traffic. 19, 770-785 (2018).
- Mateja, A., et al. Protein targeting. Structure of the Get3 targeting factor in complex with its membrane protein cargo. Science. 347, 1152-1155 (2015).
- Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138, 628-644 (2009).
- Chitwood, P. J., Hegde, R. S. An intramembrane chaperone complex facilitates membrane protein biogenesis. Nature. , (2020).
- Chitwood, P. J., Juszkiewicz, S., Guna, A., Shao, S., Hegde, R. S. EMC Is Required to Initiate Accurate Membrane Protein Topogenesis. Cell. 175, 1-30 (2018).
- Bock, F. J., Tait, S. W. G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21, 85-100 (2020).
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, (2019).
- Bykov, Y. S., Rapaport, D., Herrmann, J. M., Schuldiner, M. Cytosolic Events in the Biogenesis of Mitochondrial Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 45, 650-667 (2020).
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 427, 1135 (2019).
- Borgese, N., Coy-Vergara, J., Colombo, S. F., Schwappach, B. The Ways of Tails: the GET Pathway and more. The Protein Journal. , 1-17 (2019).
- Mateja, A., Keenan, R. J. A structural perspective on tail-anchored protein biogenesis by the GET pathway. Current Opinion in Structural Biology. 51, 195-202 (2018).
- Chio, U. S., Cho, H., Shan, S. Mechanisms of Tail-Anchored Membrane Protein Targeting and Insertion. Annual review of cell and developmental biology. 33, 417-438 (2017).
- Denic, V. A portrait of the GET pathway as a surprisingly complicated young man. Trends in biochemical sciences. , (2012).
- Hegde, R. S., Keenan, R. J. Tail-anchored membrane protein insertion into the endoplasmic reticulum. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12, 787-798 (2011).
- Kalbfleisch, T., Cambon, A., Wattenberg, B. W. A bioinformatics approach to identifying tail-anchored proteins in the human genome. Traffic. 8, 1687-1694 (2007).
- Doan, K. N., et al. The Mitochondrial Import Complex MIM Functions as Main Translocase for α-Helical Outer Membrane Proteins. Cell Reports. 31, (2020).
- McDowell, M. A., et al. Structural Basis of Tail-Anchored Membrane Protein Biogenesis by the GET Insertase Complex. Molecular Cell. 80, (2020).
- Guna, A., Volkmar, N., Christianson, J. C., Hegde, R. S. The ER membrane protein complex is a transmembrane domain insertase. Science. 591, 3099 (2017).
- Rao, M., et al. Multiple selection filters ensure accurate tail-anchored membrane protein targeting. eLife. 5, 21301 (2016).
- Schuldiner, M., et al. The GET complex mediates insertion of tail-anchored proteins into the ER membrane. Cell. 134, 634-645 (2008).
- Chen, Y. -. C., et al. Msp1/ATAD1 maintains mitochondrial function by facilitating the degradation of mislocalized tail-anchored proteins. The EMBO journal. 33, 1548-1564 (2014).
- Wu, X., Rapoport, T. A. Translocation of Proteins through a Distorted Lipid Bilayer. Trends in Cell Biology. , (2021).
- Phillips, B. P., Gomez-Navarro, N., Miller, E. A. Protein quality control in the endoplasmic reticulum. Current Opinion in Cell Biology. 65, 96-102 (2020).
- van de Weijer, M. L., et al. Quality Control of ER Membrane Proteins by the RNF185/Membralin Ubiquitin Ligase Complex. Molecular Cell. 79, (2020).
- Weir, N. R., Kamber, R. A., Martenson, J. S., Denic, V. The AAA protein Msp1 mediates clearance of excess tail-anchored proteins from the peroxisomal membrane. eLife. 6, 28507 (2017).
- Gardner, B. M., et al. The peroxisomal AAA-ATPase Pex1/Pex6 unfolds substrates by processive threading. Nature communications. 9, 135 (2018).
- Puchades, C., et al. Unique Structural Features of the Mitochondrial AAA+ Protease AFG3L2 Reveal the Molecular Basis for Activity in Health and Disease. Molecular Cell. , (2019).
- Castanzo, D. T., LaFrance, B., Martin, A. The AAA+ ATPase Msp1 is a processive protein translocase with robust unfoldase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 14970-14977 (2020).
- Wang, L., Myasnikov, A., Pan, X., Walter, P. Structure of the AAA protein Msp1 reveals mechanism of mislocalized membrane protein extraction. eLife. 9, (2020).
- Puchades, C., Sandate, C. R., Lander, G. C. The molecular principles governing the activity and functional diversity of AAA+ proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , 1-16 (2019).
- Yang, Y., et al. Folding-Degradation Relationship of a Membrane Protein Mediated by the Universally Conserved ATP-Dependent Protease FtsH. Journal of the American Chemical Society. , 10 (2018).
- Baldridge, R. D., Rapoport, T. A. Autoubiquitination of the Hrd1 Ligase Triggers Protein Retrotranslocation in ERAD. Cell. 166, 394-407 (2016).
- Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Sorting out how Msp1 maintains mitochondrial membrane proteostasis. Mitochondrion. 49, 128-134 (2019).
- Wang, L., Walter, P. Msp1/ATAD1 in Protein Quality Control and Regulation of Synaptic Activities. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 1-24 (2020).
- Dederer, V., et al. Cooperation of mitochondrial and ER factors in quality control of tail-anchored proteins. eLife. 8, 1126 (2019).
- Matsumoto, S., et al. Msp1 Clears Mistargeted Proteins by Facilitating Their Transfer from Mitochondria to the ER. Molecular Cell. , (2019).
- Li, L., Zheng, J., Wu, X., Jiang, H. Mitochondrial AAA-ATPase Msp1 detects mislocalized tail-anchored proteins through a dual-recognition mechanism. EMBO Reports. 20, (2019).
- Weidberg, H., Amon, A. MitoCPR – a surveillance pathway that protects mitochondria in response to protein import stress. Science. 360, (2018).
- Okreglak, V., Walter, P. The conserved AAA-ATPase Msp1 confers organelle specificity to tail-anchored proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (2014).
- Piard, J., et al. A homozygous ATAD1 mutation impairs postsynaptic AMPA receptor trafficking and causes a lethal encephalopathy. Brain. , (2018).
- Zhang, J., et al. The AAA+ ATPase Thorase regulates AMPA receptor-dependent synaptic plasticity and behavior. Cell. 145, 284-299 (2011).
- Prendergast, J., et al. Ganglioside regulation of AMPA receptor trafficking. The Journal of Neuroscience. 34, 13246-13258 (2014).
- Umanah, G. K. E., et al. Thorase variants are associated with defects in glutamatergic neurotransmission that can be rescued by Perampanel. Science Translational Medicine. 9, 4985 (2017).
- Pignatelli, M., et al. Synaptic Plasticity onto Dopamine Neurons Shapes Fear Learning. Neuron. 93, 425-440 (2017).
- Zhang, J., et al. The AAA Thorase is neuroprotective against ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , 271678 (2018).
- Umanah, G. K. E., et al. AMPA Receptor Surface Expression Is Regulated by S-Nitrosylation of Thorase and Transnitrosylation of NSF. Cell Reports. 33, 108329 (2020).
- Wohlever, M. L., Mateja, A., McGilvray, P. T., Day, K. J., Keenan, R. J. Msp1 Is a Membrane Protein Dislocase for Tail-Anchored Proteins. Molecular Cell. 67, 194-202 (2017).
- Lovell, J. F., et al. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cell. 135, 1074-1084 (2008).
- Leshchiner, E. S., Braun, C. R., Bird, G. H., Walensky, L. D. Direct activation of full-length proapoptotic BAK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 986-995 (2013).
