In situ Hibridación en larvas y juveniles de pez cebra durante el desarrollo de Mesonephros
Summary
El pez cebra es un modelo importante para comprender el desarrollo renal. Aquí, se optimiza un protocolo de hibridación in situ para detectar la expresión génica en larvas y juveniles de pez cebra durante el desarrollo de mesonephros.
Abstract
El pez cebra forma dos estructuras renales en su vida. El pronephros (riñón embrionario) se forma durante el desarrollo embrionario y comienza a funcionar a los 2 días después de la fertilización. Compuesto por solo dos nefronas, el pronephros sirve como el único riñón durante la vida larvaria hasta que se requiere más función renal debido al aumento de la masa corporal. Para hacer frente a esta mayor demanda, el mesonephros (riñón adulto) comienza a formarse durante la metamorfosis. Las nuevas nefronas primarias se fusionan con los pronefros y forman lúmenes conectados. Luego, las nefronas secundarias se fusionan con las primarias (y así sucesivamente) para crear una red de ramificación en los mesonephros. La gran mayoría de la investigación se centra en los pronephros debido a la facilidad de uso de embriones. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar técnicas para estudiar larvas y peces juveniles más viejos y más grandes para comprender mejor el desarrollo de los mesonephros. Aquí, un protocolo de hibridación in situ para el análisis de expresión génica está optimizado para la penetración de la sonda, el lavado de sondas y anticuerpos, y el blanqueo de pigmentos para visualizar mejor los mesonephros. La línea transgénica Tg(lhx1a-EGFP) se utiliza para etiquetar las células progenitoras y los túbulos distales de las nefronas nacientes. Este protocolo llena un vacío en la investigación de mesonephros. Es un modelo crucial para comprender cómo se forman e integran los nuevos tejidos renales con las nefronas existentes y proporcionar información sobre las terapias regenerativas.
Introduction
El embrión de pez cebra es un modelo importante para estudiar el desarrollo tisular debido a su pequeño tamaño, transparencia, herramientas disponibles y supervivencia sin alimentación hasta por cinco días1,2. Ha contribuido en gran medida a la comprensión del desarrollo renal y la conservación entre el pez cebra y los mamíferos3,4,5. El riñón juega un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis de líquidos, filtrando la sangre y excretando desechos6. La nefrona, la unidad funcional del riñón, comprende un filtro de sangre conectado a un túbulo largo. En el pez cebra, se forman dos estructuras renales a lo largo de su vida. El pronephros (el riñón embrionario temporal) se forma primero durante el desarrollo temprano. Consiste en dos nefronas que corren a lo largo del eje anterior-posterior y se vuelve funcional alrededor de los 2 días posteriores a la fertilización (dpf). La utilidad del pronephros radica en su simplicidad, teniendo solo dos nefronas que son en su mayoría lineales y fáciles de visualizar (aunque el túbulo contorneado proximal comienza a enrollarse a tres dpf)3. Esto ha facilitado no solo los estudios de su desarrollo temprano a partir del mesodermo intermedio, sino también el patrón de segmentación y reparación de túbulos7,8.
La utilidad del pez cebra se limita después de cinco dpf, cuando la yema disminuye y las larvas dependen de la alimentación en el sistema acuático9. Alrededor de las 2 semanas de edad, las larvas sufren metamorfosis en juveniles, donde se forman nuevos tejidos y se pierden y/o reorganizan tejidos viejos9. Esto es también cuando se forma el mesonephros (el riñón adulto permanente)10,11,12. La primera nefrona adulta se forma cerca del sexto somita, y se fusiona con el túbulo temprano distal del pronephros. Las nefronas adicionales se agregan después de esta posición inicialmente, pero también hacia la anterior más adelante. Las nefronas primarias en esta primera ola se fusionan con los túbulos de los pronefros y comparten un lumen común para depositar sus desechos. Las nefronas secundarias se forman en la siguiente ola y se fusionan con las nefronas primarias. Este proceso reiterativo crea un mesonephros que está ramificado, algo similar al riñón de los mamíferos. Presumiblemente, el pronephros eventualmente pierde su identidad de túbulo y se convierte en dos conductos colectores principales donde todas las nefronas drenan sus desechos13.
Antes de la formación de la primera nefrona adulta, las células progenitoras individuales comienzan a aparecer en larvas de ~ 4 mm (longitud total) (~ 10 dpf). Estas células, que están marcadas en la línea transgénica Tg(lhx1a-EGFP), se adhieren a los pronephros y parecen migrar a futuros sitios de nefrogénesis. Las células individuales se unen en grupos, que se diferencian en nuevas nefronas12. No está claro dónde residen estas células o qué genes expresan antes del inicio de la mesonefrogénesis.
Comprender el desarrollo de los mesonephros proporciona información sobre el riñón de los mamíferos de maneras que los pronephros no pueden. Estos incluyen la formación de agregados nefrogénicos a partir de células progenitoras individuales, la integración funcional de nuevas nefronas con las existentes y la morfogénesis ramificada. Sin embargo, existen limitaciones para estudiar el desarrollo postembrionario. Las larvas son menos transparentes debido a su mayor tamaño y a que tienen pigmentación. La línea de tiempo del desarrollo no es sincrónica entre los animales individuales y depende en gran medida de factores ambientales, como la alimentación y el hacinamiento9,14. Aunque existen reactivos de derribo, son menos efectivos en larvas en comparación con embriones15. En este protocolo, se describe un método de hibridación in situ para determinar la expresión génica durante el desarrollo del pez cebra mesonephros. Se optimizan varios pasos para aumentar la visualización de los mesonefros y la penetración y el lavado de la sonda y el anticuerpo. La línea transgénica Tg(lhx1a-EGFP) se utiliza junto con una sonda para EGFP para etiquetar células progenitoras individuales, agregados nefrogénicos y los túbulos distales de las nefronas nacientes. Este método proporcionará una comprensión más profunda del desarrollo de mesonephros y una visión de las terapias regenerativas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método de hibridación in situ descrito aquí está dirigido a estudiar el desarrollo de mesonephros. Sin embargo, se puede aplicar para estudiar el desarrollo de otros tejidos y órganos durante la metamorfosis, como el intestino, el sistema nervioso, las escamas y la pigmentación14. Se pueden generar sondas para genes endógenos o marcadores fluorescentes en líneas transgénicas.
Es fundamental que las larvas permanezcan intactas para observar los órga…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La financiación fue proporcionada por la Academia de Ciencias de Pensilvania, y los Biólogos de la Mancomunidad de Pensilvania, y la Universidad de Indiana de Pensilvania (Escuela de Estudios de Posgrado e Investigación, Departamento de Biología y el Fondo de Biología de Pregrado Cynthia Sushak para la Excelencia). La línea transgénica Tg(lhx1a-EGFP) fue proporcionada por el Dr. Neil Hukriede (Universidad de Pittsburgh).
Materials
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
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