आवर्ती गर्भपात में चार एंडोमेट्रियल इम्यून सेल प्रकारों के मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग
Summary
मल्टीप्लेक्स इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग में प्रगति के बावजूद, एंडोमेट्रियम में एक साथ प्रमुख प्रतिरक्षा कोशिकाओं के घनत्व और क्लस्टरिंग की विशेषता एक चुनौती बनी हुई है। यह पेपर एंडोमेट्रियम में चार प्रतिरक्षा सेल प्रकारों के एक साथ स्थानीयकरण के लिए एक विस्तृत मल्टीप्लेक्स धुंधला प्रोटोकॉल और इमेजिंग का वर्णन करता है।
Abstract
इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री जैविक अनुसंधान और नैदानिक निदान में ऊतक एंटीजन की पहचान और दृश्य के लिए सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली विधि है। इसका उपयोग विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं या विकृतियों की विशेषता के लिए किया जा सकता है, जैसे घाव-उपचार, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, ऊतक अस्वीकृति, और ऊतक-बायोमटेरियल इंटरैक्शन। हालांकि, पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) धुंधला का उपयोग करके एक ही ऊतक अनुभाग में कई एंटीजन (विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए) का दृश्य और मात्राकरण असंतोषजनक बना हुआ है। इसलिए, हाल के वर्षों में एक ऊतक नमूने या विभिन्न ऊतक नमूनों के एक कलाकारों की टुकड़ी में कई जैविक मार्कर की पहचान करने के लिए मल्टीप्लेक्स प्रौद्योगिकियों को पेश किया गया था ।
ये प्रौद्योगिकियां प्रत्यारोपण के दौरान आवर्ती गर्भपात के साथ उपजाऊ महिलाओं और महिलाओं के बीच एंडोमेट्रियम के भीतर प्रतिरक्षा सेल-टू-सेल इंटरैक्शन में परिवर्तन को अलग करने में विशेष रूप से उपयोगी हो सकती हैं। यह पत्र भ्रूण प्रत्यारोपण के दौरान ठीक समय पर एंडोमेट्रियल नमूनों में एक साथ चार प्रमुख प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों के घनत्व और क्लस्टरिंग की जांच करने के लिए मल्टीप्लेक्स फ्लोरेसेंस आईएचसी धुंधला के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है । इस विधि में नमूना तैयारी, प्रतिरक्षा कोशिका उपप्रकारों के लिए मार्कर के साथ मल्टीप्लेक्स अनुकूलन, और स्लाइडों की स्कैनिंग, डेटा विश्लेषण के बाद, एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का पता लगाने के लिए विशिष्ट संदर्भ के साथ शामिल है।
इस विधि का उपयोग करके, एंडोमेट्रियम में चार प्रमुख प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों के घनत्व और क्लस्टरिंग का एक साथ एक ही ऊतक अनुभाग में विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, यह पेपर लागू की जा रही फ्लोरोसेंट जांच के बीच संभावित फ्लोरोफोर हस्तक्षेप को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण कारकों और समस्या निवारण पर चर्चा करेगा। महत्वपूर्ण बात यह है कि इस मल्टीप्लेक्स स्टेनिंग तकनीक के परिणाम भ्रूण प्रत्यारोपण के दौरान इम्यूनोलॉजिक इंटरैक्शन और नियमन की गहराई से समझ प्रदान करने में मदद कर सकते हैं ।
Introduction
गर्भकाल1के 24 सप्ताह से पहले दो या अधिक गर्भधारण के नुकसान के रूप में आवर्ती गर्भपात (आरएम) को परिभाषित किया जा सकता है। बार – बार प्रजनन की यह स्थिति दुनिया भर में 1% तक जोड़ों को प्रभावित करती है2,3. रोगविज्ञान बहुरूपी है और इसे भ्रूणीय रूप से संचालित कारणों (मुख्य रूप से असामान्य भ्रूणीय कारियोटाइप के कारण) और मातृ चालित कारणों में विभाजित किया जा सकता है जो एंडोमेट्रियम और/या अपरा विकास को प्रभावित करते हैं । इस अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप माता-पिता की आनुवंशिक असामान्यताएं, गर्भाशय विसंगतियां, प्रोथ्रोम्बोटिक स्थितियां, एंडोक्राइनोलॉजी कारक और इम्यूनोलॉजिकल विकार4हो सकते हैं।
हाल के वर्षों में, प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिका रोग जल्दी गर्भावस्था हानि5के रोगजनन में फंसाया गया है । इसने प्रारंभिक गर्भावस्था में विशिष्ट भूमिकाओं के साथ मासिक धर्म चक्र, प्रत्यारोपण और प्रारंभिक गर्भावस्था के दौरान एंडोमेट्रियम में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की विशिष्ट आबादी को स्पष्ट करने में कई जांचों को प्रेरित किया है। इन प्रतिरक्षा कोशिकाओं में, गर्भाशय प्राकृतिक हत्यारा (यूएनके) कोशिकाएं भ्रूण प्रत्यारोपण और गर्भावस्था के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, विशेष रूप से ट्रोफोब्लास्टिक आक्रमण और एंजियोजेनेसिस6की प्रक्रियाओं में। अध्ययनों से पता चला है कि आरएम7,8वाली महिलाओं के एंडोमेट्रियम में यूएनके सेल घनत्व में वृद्धि हुई है,हालांकि यह निष्कर्ष गर्भपात के बढ़ते जोखिम से जुड़ा नहीं था9. हालांकि, इस ने आरएम10, 11के साथ महिलाओं में एंडोमेट्रियम में अन्य प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों (जैसे मैक्रोफेज, गर्भाशय डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं) के घनत्व का मूल्यांकन करने वाले शोध को प्रेरित किया। फिर भी, यह अनिश्चित रहता है कि क्या आरएम के साथ महिलाओं में पेरी-इम्प्लांटेशन एंडोमेट्रियम में प्रतिरक्षा कोशिका घनत्व में महत्वपूर्ण परिवर्तन होता है।
अनिश्चितता के लिए एक संभव स्पष्टीकरण यह है कि एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा सेल घनत्व का मूल्यांकन प्रत्यारोपण की खिड़की के दौरान एंडोमेट्रियम में तेजी से परिवर्तन के कारण मुश्किल हो सकता है। 24 घंटे की समय सीमा के दौरान, एंडोमेट्रियम में महत्वपूर्ण परिवर्तन प्रतिरक्षा कोशिका घनत्व और साइटोकिन स्राव को बदलते हैं, इन परिणामों में भिन्नता का स्रोत पेश करतेहैं 12। इसके अलावा, अधिकांश रिपोर्टें मुख्य रूप से एकल-सेल धुंधला (जैसे, पारंपरिक आईएचसी विधियों) के उपयोग पर निर्भर करती हैं जो एक ही ऊतक अनुभाग पर कई मार्कर की जांच नहीं कर सकते थे। यद्यपि प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग एक ही नमूने में कई सेल आबादी का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, लेकिन आवश्यक कोशिकाओं की बड़ी मात्रा और समय लेने वाली अनुकूलन इस विधि की लोकप्रियता और दक्षता में बाधा डालता है। इसलिए, मल्टीप्लेक्स आईएचसी धुंधला में हाल ही में उन्नति सेल वंश और व्यक्तिगत प्रतिरक्षा उपआबादी के हिस्टोलॉजिकल स्थानीयकरण सहित कई मापदंडों का मूल्यांकन करने के लिए एक ही स्लाइड पर कई मार्कर इम्यूनोदाता द्वारा इस समस्या को हल कर सकता है । इसके अलावा, यह तकनीक सीमित ऊतक उपलब्धता के मामले में प्राप्त जानकारी को अधिकतम कर सकती है। अंततः, यह तकनीक उपजाऊ महिलाओं और आरएम के साथ महिलाओं के बीच एंडोमेट्रियम में प्रतिरक्षा सेल इंटरैक्शन में अंतर को स्पष्ट करने में मदद कर सकती है।
महिलाओं के दो समूहों को प्रिंस ऑफ वेल्स अस्पताल से भर्ती किया गया, जिसमें उपजाऊ नियंत्रण महिलाओं (एफसी) और अस्पष्टीकृत आवर्ती गर्भपात (आरएम) वाली महिलाएं शामिल हैं । उपजाऊ नियंत्रण महिलाओं को जो सहज गर्भपात के किसी भी इतिहास के बिना कम से एक जीवित जंम था के रूप में परिभाषित किया गया था, और आरएम महिलाओं को जो 20 सप्ताह के गर्भ से पहले ≥२ लगातार गर्भपात का इतिहास था के रूप में परिभाषित किया गया । दोनों समूहों के विषयों ने निम्नलिखित समावेशन मानदंडों को पूरा किया: (क) 20 से ४२ वर्ष के बीच की आयु, (ख) धूम्रपान न करने वाले, (ग) नियमित मासिक धर्म चक्र (25-35 दिन) और सामान्य गर्भाशय संरचना, (घ) एंडोमेट्रियल बायोप्सी से कम से कम 3 महीने पहले किसी भी हार्मोनल आहार का कोई उपयोग नहीं, (ई) हिस्टेरो-साल्पिंगोग्राम द्वारा हाइड्रोसालपिंक्स नहीं। इसके अलावा भर्ती किए गए सभी विषयों में सामान्य कारियोटाइपिंग, सामान्य 3-डायमेंशनल अल्ट्रासोनोग्राफी हिस्टीरोसलपिंगोग्राम, दिन 2 कूप उत्तेजक हार्मोन 30 एनएमओल/एल, नॉर्मल थायराइड फंक्शन, और ल्यूपस एंटीकोगुलांट और एंटीकार्डियोलीपिन आईजीजीजी और इग्म एंटीबॉडीज के लिए निगेटिव टेस्ट किया गया ।
आरएम के प्रतिरक्षा आधार को बेहतर ढंग से समझने के लिए, प्रत्यारोपण के समय एंडोमेट्रियम में मौजूद प्रमुख प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों को एक साथ मात्रा निर्धारित करना और स्थानीयकरण करना सबसे वांछनीय होगा। यह पेपर नमूना तैयार करने से पूरे प्रोटोकॉल, प्रतिरक्षा सेल उपप्रकारों के लिए मार्कर के साथ मल्टीप्लेक्स अनुकूलन, और स्लाइडों की स्कैनिंग का वर्णन करता है, इसके बाद एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का पता लगाने के लिए विशिष्ट संदर्भ के साथ डेटा विश्लेषण किया जाता है। इसके अलावा, यह पेपर एंडोमेट्रियम में एक साथ प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों के घनत्व और क्लस्टरिंग को निर्धारित करने का वर्णन करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि मल्टीप्लेक्स धुंधला करने के लिए मेहनती अनुकूलन की आवश्यकता होती है। एंटीजन पुनर्प्राप्ति, साइट्रेट बफर और माइक्रोवेव तकनीक क?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को हांगकांग प्रसूति और स्त्री रोग ट्रस्ट फंड द्वारा 2018 में और हांगकांग स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान कोष (06170186, 07180226) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
Riferimenti
- ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).
- Stirrat, G. M. Recurrent miscarriage. Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).
- Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
- Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
- King, A. Uterine leukocytes and decidualization. Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).
- Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
- Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
- Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
- Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
- Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
- Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
- Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, 26-36 (1999).
- Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).
