Multiplexed fluorescerende immunohistokemisk farvning af fire endometrie immuncelletyper i tilbagevendende abort
Summary
På trods af fremskridt i multiplex immunohistochemistry og multispektral billeddannelse, karakterisere tætheden og klyngedannelse af store immunceller samtidigt i endometriet er fortsat en udfordring. Dette papir beskriver en detaljeret multiplex farvning protokol og billeddannelse for samtidig lokalisering af fire immuncelletyper i endometriet.
Abstract
Immunohistochemistry er den mest anvendte metode til identifikation og visualisering af vævsantigener i biologisk forskning og klinisk diagnostik. Det kan bruges til at karakterisere forskellige biologiske processer eller patologier, såsom sårheling, immunrespons, væv afvisning, og væv-biomateriale interaktioner. Visualiseringen og kvantificeringen af flere antigener (især for immunceller) i en enkelt vævssektion ved hjælp af konventionel immunhistokemisk (IHC) farvning er dog fortsat utilfredsstillende. Derfor blev multiplexed teknologier indført i de seneste år for at identificere flere biologiske markører i en enkelt vævsprøve eller et ensemble af forskellige vævsprøver.
Disse teknologier kan især være nyttige til at differentiere ændringerne i immuncelle-til-celle interaktioner inden for endometriet mellem frugtbare kvinder og kvinder med tilbagevendende aborter under implantation. Dette papir beskriver en detaljeret protokol for multiplexed fluorescens IHC farvning til at undersøge tætheden og klyngedannelse af fire store immuncelletyper samtidigt i præcist timede endometrieprøver under embryo implantation. Metoden omfatter prøveforberedelse, multiplexoptimering med markører for immuncelleundertyper og scanning af diasene efterfulgt af dataanalyse med særlig henvisning til detektering af endometrieimmunceller.
Ved hjælp af denne metode kan tætheden og klyngedannelsen af fire store immuncelletyper i endometriet samtidig analyseres i en enkelt vævssektion. Derudover vil dette papir diskutere de kritiske faktorer og fejlfinding for at overvinde mulig fluorophore interferens mellem de fluorescerende sonder, der anvendes. Vigtigere er det, at resultaterne fra denne multiplex farvningsteknik kan hjælpe med at give en dybdegående forståelse af den immunologiske interaktion og regulering under embryoimplantatering.
Introduction
Tilbagevendende abort (RM) kan defineres som tab af to eller flere graviditeter før 24 ugers svangerskab1. Denne hyppige reproduktive tilstand påvirker op til 1% af par på verdensplan2,3. Patofysiologien er multifaktoriel og kan opdeles i embryologisk drevne årsager (primært på grund af en unormal embryonal karyotype) og maternally drevne årsager, der påvirker endometrium og / eller placental udvikling. Denne manifestation kan skyldes forældrenes genetiske abnormiteter, livmoderanomalier, prothrombotiske tilstande, endokrinologiske faktorer og immunologiske lidelser4.
I de senere år har immuneffektorcelledysfunktion været impliceret i patogenesen af tidlig graviditetstab5. Dette har inspireret mange undersøgelser af belyse de specifikke populationer af immunceller i endometriet under menstruationscyklus, implantation, og tidlig graviditet, med specifikke roller i den tidlige graviditet. Blandt disse immunceller spiller livmoder naturlige dræber (uNK) celler en afgørende rolle under embryoimplantation og graviditet, især i processerne for trofoblastic invasion og angiogenese6. Undersøgelser har vist en øget uNK-celletæthed i endometriet hos kvinder med RM7,8, selv om dette fund ikke var forbundet med en øget risiko for abort9. Dette stimulerede imidlertid forskning, der evaluerede tætheden af andre immuncelletyper (såsom makrofager, livmoderdendritiske celler) i endometriet hos kvinder med RM10,11. Ikke desto mindre er det fortsat usikkert, om der er en signifikant ændring i immuncelletætheden i peri-implantation endometrium hos kvinder med RM.
En mulig forklaring på usikkerheden er, at det kan være vanskeligt at vurdere den endometriske immuncelletæthed på grund af de hurtige ændringer i endometriet under implantationsvinduet. I løbet af 24 timers tidsrammen ændrer signifikante ændringer i endometrium immuncelletætheden og cytokinsekretionen, hvilket introducerer en kilde til variation i disse resultater12. Derudover er de fleste rapporter hovedsageligt afhængige af brugen af enkeltcellet farvning (f.eks. traditionelle IHC-metoder), der ikke kunne undersøge flere markører på samme vævssektion. Selvom flowcytometri kan bruges til at detektere flere cellepopulationer i en enkelt prøve, forhindrer de store mængder celler, der kræves, og den tidskrævende optimering populariteten og effektiviteten af denne metode. Derfor kan den seneste udvikling i multiplex IHC farvning løse dette problem ved at immunstaine flere markører på samme dias til at evaluere flere parametre, herunder celle afstamning og histologisk lokalisering af individuelle immun subpopulationer. Desuden kan denne teknologi maksimere de oplysninger, der opnås i tilfælde af begrænset væv tilgængelighed. I sidste ende kan denne teknik hjælpe med at belyse forskellene i immuncelleinteraktioner i endometriet mellem frugtbare kvinder og kvinder med RM.
To grupper af kvinder blev rekrutteret fra Prince of Wales Hospital, herunder frugtbare kontrol kvinder (FC) og kvinder med uforklarlige tilbagevendende abort (RM). Frugtbar kontrol blev defineret som kvinder, der havde mindst én levende fødsel uden nogen historie af spontan abort, og RM kvinder blev defineret som dem, der havde en historie af ≥2 på hinanden følgende aborter før 20 uger svangerskab. Forsøgspersonerne fra de to grupper opfyldte følgende inklusionskriterier: a) alder mellem 20 og 42 år, b) ikke-ryger, c) regelmæssig menstruationscyklus (25-35 dage) og normal livmoderstruktur, d) ingen brug af hormonelt regime i mindst 3 måneder før endometriebiopsi, (e) ingen hydrosalpinx ved hystero-salpingogram. Derudover havde alle de rekrutterede forsøgspersoner normal karyotyping, normal 3-dimensionel ultrasonografihysterosalpingogram, dag 2 follikelstimulerende hormon 30 nmol/L, normal skjoldbruskkirtelfunktion og testet negativ for lupus antikkoagulant og antikardiolipin IgG- og IgM-antistoffer.
For bedre at forstå rm’s immunologiske grundlag ville det være mest ønskeligt samtidig at kvantificere og lokalisere de store immuncelletyper, der findes i endometriet på implantationstidspunktet. Dette papir beskriver hele protokollen fra prøveforberedelse, multiplexoptimering med markører for immuncelleundertyper og scanning af diasene efterfulgt af dataanalyse med specifik henvisning til detektering af endometrieimmunceller. Desuden beskriver dette papir, hvordan man bestemmer tætheden og klyngedannelsen af immuncelletyperne samtidigt i endometriet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trin i protokollen
Det er vigtigt at bemærke, at multiplex farvning kræver omhyggelig optimering. Antigen hentning, ved hjælp af citrat buffer og mikrobølge teknologi, kræver optimering for at sikre fuldstændig antistof stripning og opretholde væv levedygtighed. Da TSA-reagenser kovalent binder sig til steder omkring antigen, kan de potentielt hæmme bindingen af et efterfølgende primært antistof gennem sterisk hindring (også kendt som “paraplyeffekten”). Dette har tendens til at fo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund i 2018 og Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).
Materials
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
Riferimenti
- ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).
- Stirrat, G. M. Recurrent miscarriage. Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).
- Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
- Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
- King, A. Uterine leukocytes and decidualization. Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).
- Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
- Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
- Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
- Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
- Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
- Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
- Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, 26-36 (1999).
- Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).
