כתמים אימונוהיסטוכימיים פלואורסצנטיים מרובים של ארבעה סוגי תאי מערכת החיסון רירית הרחם בהפלה חוזרת ונשנית
Summary
למרות ההתקדמות באימונוהיסטוכימיה מולטיפלקס והדמיה רב ספקטרלית, אפיון הצפיפות וההקבצות של תאי מערכת החיסון העיקריים בו זמנית באנדומטריום נותר אתגר. מאמר זה מתאר פרוטוקול מכתים מולטיפלקס מפורט והדמיה עבור לוקליזציה בו זמנית של ארבעה סוגי תאי מערכת החיסון באנדומטריום.
Abstract
אימונוהיסטוכימיה היא השיטה הנפוצה ביותר לזיהוי והדמיה של אנטיגנים רקמה במחקר ביולוגי ואבחון קליני. זה יכול לשמש כדי לאפיין תהליכים ביולוגיים שונים או פתולוגיות, כגון ריפוי פצעים, תגובה חיסונית, דחיית רקמות, ואינטראקציות רקמות-biomaterial. עם זאת, ההדמיה וכימות של אנטיגנים מרובים (במיוחד עבור תאי מערכת החיסון) בסעיף רקמה אחת באמצעות כתמים אימונוהיסטוכימיים קונבנציונליים (IHC) נותר לא משביע רצון. לפיכך, טכנולוגיות מולטיפלקס הוצגו בשנים האחרונות כדי לזהות סמנים ביולוגיים מרובים בדגימת רקמה אחת או הרכב של דגימות רקמות שונות.
טכנולוגיות אלה יכולות להיות שימושיות במיוחד בהבחנה בין השינויים באינטראקציות בין תאים בתוך רירית הרחם בין נשים פוריות ונשים עם הפלות חוזרות ונשנות במהלך ההשתלה. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט להכתמת IHC פלואורסצנטיות מרובת-קסים כדי לחקור את הצפיפות וההקבצות של ארבעה סוגי תאי חיסון עיקריים בו זמנית בדגימות רירית הרחם המתוזמנות במדויק במהלך השתלת העובר. השיטה כוללת הכנת מדגם, אופטימיזציה מולטיפלקס עם סמנים עבור תת-סוגים של תאי מערכת החיסון, ואת הסריקה של השקופיות, ואחריו ניתוח נתונים, עם התייחסות ספציפית לזיהוי תאי מערכת החיסון רירית הרחם.
בשיטה זו, ניתן לנתח בו זמנית את הצפיפות והאשכול של ארבעה סוגי תאי מערכת החיסון העיקריים באנדומטריום בסעיף רקמה אחת. בנוסף, מאמר זה ידון בגורמים הקריטיים ובפתרון בעיות כדי להתגבר על הפרעות פלואורופור אפשריות בין הבדיקות הפלואורסצנטיות המיושמות. חשוב לציין, התוצאות מטכניקת הכתמת מולטיפלקס זו יכולות לסייע בהבנה מעמיקה של האינטראקציה והוויסות האימונולוגיים במהלך השתלת העובר.
Introduction
הפלה חוזרת (RM) יכולה להיות מוגדרת כהפסד של שני הריונות או יותר לפני 24 שבועות של הריון1. מצב פוריות תכוף זה משפיע על עד 1% מהזוגות ברחבי העולם2,3. הפתופיזיולוגיה היא רב-גורמית וניתן לחלקה לגורמים עובריים (בעיקר בשל קריוטיפ עוברי חריג) וגורמים מונעים אימהית המשפיעים על רירית הרחם ו/או התפתחות השליה. ביטוי זה יכול לנבוע מפגמים גנטיים הוריים, אנומליות ברחם, מצבים פרותרומבוטיים, גורמים אנדוקרינולוגיים והפרעות אימונולוגיות4.
בשנים האחרונות, תפקוד לקוי של תאי המחולל החיסוני היה מעורב בפתוגנזה של אובדן הריון מוקדם5. זה השראה חקירות רבות לתוך לפרט את האוכלוסיות הספציפיות של תאי מערכת החיסון באנדומטריום במהלך המחזור החודשי, ההשתלה, והריון מוקדם, עם תפקידים ספציפיים בתחילת ההריון. בין תאי מערכת החיסון האלה, תאי הרוצח הטבעי הרחם (uNK) ממלאים תפקיד קריטי במהלך השתלת העובר וההריון, במיוחד בתהליכי פלישה trophoblastic ו אנגיוגנזה6. מחקרים הראו צפיפות תאי uNK מוגברת באנדומטריום של נשים עם RM7,8, אם כי ממצא זה לא היה קשור לסיכון מוגבר להפלה9. עם זאת, מחקר זה עורר הערכת הצפיפות של סוגי תאי חיסון אחרים (כגון מקרופאגים, תאים דנדריטיים ברחם) באנדומטריום אצל נשים עם RM10,11. עם זאת, עדיין לא ברור אם יש שינוי משמעותי בצפיפות תאי החיסון באנדומטריום פרי-השתלה אצל נשים עם RM.
הסבר אפשרי אחד לאי הוודאות הוא שהערכת צפיפות תאי החיסון רירית הרחם עשויה להיות קשה בשל השינויים המהירים באנדומטריום במהלך חלון ההשתלה. במהלך מסגרת הזמן של 24 שעות, שינויים משמעותיים רירית הרחם לשנות את צפיפות תאי החיסון הפרשת ציטוקינים, הצגת מקור של וריאציה בתוצאות אלה12. בנוסף, רוב הדיווחים מסתמכים בעיקר על השימוש בהכתמה של תא יחיד (למשל, שיטות IHC מסורתיות) שלא יכלו לבחון סמנים מרובים באותו מקטע רקמות. למרות ציטומטריית זרימה יכול לשמש לאיתור אוכלוסיות תאים מרובים במדגם אחד, כמויות גדולות של תאים הנדרשים ואת אופטימיזציה זמן רב לעכב את הפופולריות והיעילות של שיטה זו. לפיכך, ההתקדמות האחרונה בהכתמת IHC מולטיפלקס יכולה לפתור בעיה זו על ידי חיסון סמנים מרובים באותה שקופית כדי להעריך פרמטרים מרובים, כולל שושלת תאים ולוקליזציה היסתולוגית של תת-אוכלוסיות חיסוניות בודדות. יתר על כן, טכנולוגיה זו יכולה למקסם את המידע המתקבל במקרה של זמינות רקמות מוגבלת. בסופו של דבר, טכניקה זו יכולה לעזור לברוח את ההבדלים באינטראקציות תאי החיסון באנדומטריום בין נשים פוריות ונשים עם RM.
שתי קבוצות של נשים גויסו מבית החולים הנסיך מוויילס, כולל נשים פוריות (FC) ונשים עם הפלה חוזרת בלתי מוסברת (RM). שליטה פורייה הוגדרה כנשים שלפחות לידה חיה אחת ללא כל היסטוריה של הפלה ספונטנית, ונשות RM הוגדרו כמי שהיו להם היסטוריה של ≥2 הפלות רצופות לפני 20 שבועות ההריון. הנבדקים משתי הקבוצות עמדו בקריטריוני ההכללה הבאים: (א) גיל בין 20 ל -42 שנים, (ב) לא מעשן, (ג) מחזור וסת רגיל (25-35 ימים) ומבנה הרחם הרגיל, (ד) אין שימוש בכל משטר הורמונלי לפחות 3 חודשים לפני הביופסיה רירית הרחם, (ה) ללא הידרוסלפינקס על ידי היסטרו-salpingogram. בנוסף, כל הנבדקים שגויסו היו קריוטיפינג רגיל, אולטרה-סאונד נורמלי 3 ממדים היסטרוזלפינוגרמה, יום 2 הורמון מגרה זקיק 30 נמול / L, תפקוד בלוטת התריס נורמלי, ונבדק שלילי עבור זאבת נוגדן קרישה ו נוגדני Iticardioliping ו- IgM.
כדי להבין טוב יותר את הבסיס החיסוני של RM, רצוי ביותר לכמת ולמקם בו זמנית את סוגי תאי החיסון העיקריים הקיימים באנדומטריום בזמן ההשתלה. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול כולו מהכנת מדגם, את אופטימיזציית מולטיפלקס עם סמנים עבור תת-סוגים של תאי מערכת החיסון, ואת הסריקה של השקופיות, ואחריו ניתוח נתונים עם התייחסות ספציפית לזיהוי תאי מערכת החיסון רירית הרחם. יתר על כן, מאמר זה מתאר כיצד לקבוע את הצפיפות ואת קיבוץ של סוגי תאי החיסון בו זמנית באנדומטריום.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים בפרוטוקול
חשוב לציין כי כתמי מולטיפלקס דורשים אופטימיזציה שקדנית. אחזור אנטיגן, באמצעות טכנולוגיית חיץ סיטראט ומיקרוגל, דורש אופטימיזציה כדי להבטיח הפשטת נוגדנים מלאה ולשמור על כדאיות רקמות. כמו ריאגנטים TSA covalently לאגד לאתרים המקיפים את האנטיגן, הם יכולים לעכב את …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי קרן הנאמנות המיילדות והינקולוגית של הונג קונג בשנת 2018 וקרן הבריאות והמחקר הרפואי של הונג קונג (06170186, 07180226).
Materials
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
Riferimenti
- ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).
- Stirrat, G. M. Recurrent miscarriage. Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).
- Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
- Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
- King, A. Uterine leukocytes and decidualization. Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).
- Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
- Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
- Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
- Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
- Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
- Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
- Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, 26-36 (1999).
- Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).
