Мультиплексированное флуоресцентное иммуногистохимическое окрашивание четырех типов иммунных клеток эндометрия при рецидивирующем выкидыше
Summary
Несмотря на достижения в мультиплексной иммуногистохимии и мультиспектральной визуализации, характеристика плотности и кластеризации основных иммунных клеток одновременно в эндометрии остается проблемой. В этой статье описывается подробный протокол мультиплексного окрашивания и визуализации для одновременной локализации четырех типов иммунных клеток в эндометрии.
Abstract
Иммуногистохимия является наиболее часто используемым методом идентификации и визуализации тканевых антигенов в биологических исследованиях и клинической диагностике. Он может быть использован для характеристики различных биологических процессов или патологий, таких как заживление ран, иммунный ответ, отторжение тканей и взаимодействие тканей с биоматериалом. Однако визуализация и количественная оценка нескольких антигенов (особенно для иммунных клеток) в одном участке ткани с использованием обычного иммуногистохимического (IHC) окрашивания остается неудовлетворительной. Следовательно, в последние годы были внедрены мультиплексированные технологии для идентификации нескольких биологических маркеров в одном образце ткани или ансамбле различных образцов тканей.
Эти технологии могут быть особенно полезны для дифференциации изменений в иммунных межклеточных взаимодействиях в эндометрии между фертильными женщинами и женщинами с рецидивирующими выкидышами во время имплантации. В этой статье описывается подробный протокол мультиплексированного флуоресцентного окрашивания IHC для исследования плотности и кластеризации четырех основных типов иммунных клеток одновременно в точно синхронизированных образцах эндометрия во время имплантации эмбриона. Метод включает в себя пробоподготовку, мультиплексную оптимизацию маркерами для подтипов иммунных клеток и сканирование слайдов с последующим анализом данных с конкретной ссылкой на обнаружение иммунных клеток эндометрия.
Используя этот метод, плотность и кластеризация четырех основных типов иммунных клеток в эндометрии могут быть одновременно проанализированы в одном участке ткани. Кроме того, в этом документе будут обсуждаться критические факторы и устранение неполадок для преодоления возможной флуорофорной интерференции между применяемыми флуоресцентными зондами. Важно отметить, что результаты этого метода мультиплексного окрашивания могут помочь обеспечить глубокое понимание иммунологического взаимодействия и регуляции во время имплантации эмбриона.
Introduction
Повторный выкидыш (РМ) может быть определен как потеря двух или более беременностей до 24 недель беременности1. Этим частым репродуктивным состоянием страдает до 1% пар во всем мире2,3. Патофизиология является многофакторной и может быть разделена на эмбриологически обусловленные причины (в основном из-за аномального эмбрионального кариотипа) и материнские причины, которые влияют на эндометрий и / или плацентарное развитие. Это проявление может быть результатом родительских генетических аномалий, аномалий матки, протромботических состояний, эндокринологических факторов и иммунологических нарушений4.
В последние годы дисфункция иммунных эффекторных клеток была вовлечена в патогенез ранней потери беременности5. Это вдохновило многие исследования по выяснению конкретных популяций иммунных клеток в эндометрии во время менструального цикла, имплантации и ранней беременности, с конкретными ролями на ранних сроках беременности. Среди этих иммунных клеток клетки-естественные киллеры матки (uNK) играют решающую роль во время имплантации эмбриона и беременности, особенно в процессах трофобластической инвазии и ангиогенеза6. Исследования показали повышенную плотность клеток uNK в эндометрии женщин с РМ7,8,хотя этот вывод не был связан с повышенным рискомвыкидыша 9. Тем не менее, это стимулировало исследования, оценивающие плотность других типов иммунных клеток (таких как макрофаги, дендритные клетки матки) в эндометрии у женщин с RM10,11. Тем не менее, остается неясным, происходит ли значительное изменение плотности иммунных клеток в периимплантационном эндометрии у женщин с РМ.
Одним из возможных объяснений неопределенности является то, что оценка плотности иммунных клеток эндометрия может быть затруднена из-за быстрых изменений в эндометрии во время окна имплантации. В течение 24-часового периода значительные изменения в эндометрии изменяют плотность иммунных клеток и секрецию цитокинов, вводя источник вариаций в эти результаты12. Кроме того, большинство отчетов в основном основаны на использовании одноклеточного окрашивания (например, традиционных методов IHC), которые не могут исследовать несколько маркеров на одном и том же участке ткани. Хотя проточная цитометрия может быть использована для обнаружения нескольких клеточных популяций в одном образце, большое количество необходимых клеток и трудоемкая оптимизация препятствуют популярности и эффективности этого метода. Следовательно, недавний прогресс в мультиплексном окрашивании IHC может решить эту проблему путем иммуноокрашивания нескольких маркеров на одном слайде для оценки нескольких параметров, включая клеточную линию и гистологическую локализацию отдельных иммунных субпопуляций. Кроме того, эта технология может максимизировать информацию, полученную в случае ограниченной доступности тканей. В конечном счете, этот метод может помочь прояснить различия во взаимодействиях иммунных клеток в эндометрии между фертильными женщинами и женщинами с РМ.
Две группы женщин были набраны из больницы принца Уэльского, в том числе фертильные контрольные женщины (FC) и женщины с необъяснимым повторным выкидышем (RM). Фертильный контроль был определен как женщины, у которых был по крайней мере один живой род без какой-либо истории спонтанного выкидыша, а женщины РМ были определены как те, у кого была история ≥2 последовательных выкидышей до 20 недель беременности. Испытуемые из двух групп соответствовали следующим критериям включения: (a) возраст от 20 до 42 лет, (b) некурящий, (c) регулярный менструальный цикл (25-35 дней) и нормальная структура матки, (d) не использование какого-либо гормонального режима в течение как минимум 3 месяцев до биопсии эндометрия, (e) отсутствие гидросальпинкса с помощью гистеросальпингограммы. Кроме того, все набранные субъекты имели нормальное кариотипирование, нормальную 3-мерную ультрасонографическую гистеросальпингограмму, фолликулостимулирующий гормон 2-й день 30 нмоль / л, нормальную функцию щитовидной железы и отрицательный результат на антикоагулянты волчанки и антикардиолипиновые антитела IgG и IgM.
Чтобы лучше понять иммунологическую основу РМ, было бы наиболее желательно одновременно количественно оценить и локализовать основные типы иммунных клеток, присутствующих в эндометрии во время имплантации. В этой статье описывается весь протокол от подготовки образцов, мультиплексной оптимизации с маркерами для подтипов иммунных клеток и сканирования слайдов с последующим анализом данных с конкретной ссылкой на обнаружение иммунных клеток эндометрия. Кроме того, в данной работе описывается, как определить плотность и кластеризацию типов иммунных клеток одновременно в эндометрии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги в рамках протокола
Важно отметить, что мультиплексное окрашивание требует тщательной оптимизации. Извлечение антигена с использованием цитратного буфера и микроволновой технологии требует оптимизации для обеспечения полного удаления антител и поддержан…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Гонконгским акушерско-гинекологическим трастовым фондом в 2018 году и Гонконгским фондом здравоохранения и медицинских исследований (06170186, 07180226).
Materials
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
Riferimenti
- ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).
- Stirrat, G. M. Recurrent miscarriage. Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).
- Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
- Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
- King, A. Uterine leukocytes and decidualization. Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).
- Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
- Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
- Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
- Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
- Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
- Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
- Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, 26-36 (1999).
- Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).
