Tinción inmunohistoquímica fluorescente multiplexada de cuatro tipos de células inmunes endometriales en aborto espontáneo recurrente
Summary
A pesar de los avances en inmunohistoquímica multiplex e imágenes multiespectrales, la caracterización de la densidad y la agrupación de las principales células inmunes simultáneamente en el endometrio sigue siendo un desafío. Este artículo describe un protocolo detallado de tinción multiplex e imágenes para la localización simultánea de cuatro tipos de células inmunes en el endometrio.
Abstract
La inmunohistoquímica es el método más utilizado para la identificación y visualización de antígenos tisulares en la investigación biológica y el diagnóstico clínico. Se puede utilizar para caracterizar diversos procesos biológicos o patologías, como la cicatrización de heridas, la respuesta inmune, el rechazo de tejidos y las interacciones tejido-biomaterial. Sin embargo, la visualización y cuantificación de múltiples antígenos (especialmente para las células inmunes) en una sola sección de tejido utilizando tinción inmunohistoquímica convencional (IHC) sigue siendo insatisfactoria. Por lo tanto, las tecnologías multiplexadas se introdujeron en los últimos años para identificar múltiples marcadores biológicos en una sola muestra de tejido o un conjunto de diferentes muestras de tejido.
Estas tecnologías pueden ser especialmente útiles para diferenciar los cambios en las interacciones inmunes de célula a célula dentro del endometrio entre mujeres fértiles y mujeres con abortos espontáneos recurrentes durante la implantación. Este artículo describe un protocolo detallado para la tinción de fluorescencia multiplexada IHC para investigar la densidad y la agrupación de cuatro tipos principales de células inmunes simultáneamente en muestras endometriales cronometradas con precisión durante la implantación embrionaria. El método incluye la preparación de muestras, la optimización multiplex con marcadores para subtipos de células inmunes y el escaneo de las diapositivas, seguido de análisis de datos, con referencia específica a la detección de células inmunes endometriales.
Usando este método, la densidad y la agrupación de cuatro tipos principales de células inmunes en el endometrio se pueden analizar simultáneamente en una sola sección de tejido. Además, este documento discutirá los factores críticos y la solución de problemas para superar la posible interferencia de fluoróforos entre las sondas fluorescentes que se aplican. Es importante destacar que los resultados de esta técnica de tinción multiplex pueden ayudar a proporcionar una comprensión profunda de la interacción inmunológica y la regulación durante la implantación del embrión.
Introduction
El aborto espontáneo recurrente (RM) se puede definir como la pérdida de dos o más embarazos antes de las 24 semanas de gestación1. Esta condición reproductiva frecuente afecta hasta al 1% de las parejas en todo el mundo2,3. La fisiopatología es multifactorial y se puede dividir en causas impulsadas embriológicamente (principalmente debido a un cariotipo embrionario anormal) y causas impulsadas por la madre que afectan el endometrio y / o el desarrollo placentario. Esta manifestación puede ser el resultado de anomalías genéticas parentales, anomalías uterinas, afecciones protrombóticas, factores de endocrinología y trastornos inmunológicos4.
En los últimos años, la disfunción de las células inmunofectoras se ha implicado en la patogénesis de la pérdida temprana del embarazo5. Esto ha inspirado muchas investigaciones para dilucidar las poblaciones específicas de células inmunes en el endometrio durante el ciclo menstrual, la implantación y el embarazo temprano, con funciones específicas en el embarazo temprano. Entre estas células inmunes, las células asesinas naturales uterinas (uNK) juegan un papel crítico durante la implantación embrionaria y el embarazo, particularmente en los procesos de invasión trofoblástica y angiogénesis6. Los estudios han demostrado un aumento de la densidad celular uNK en el endometrio de mujeres con RM7,8,aunque este hallazgo no se asoció con un mayor riesgo de aborto espontáneo9. Sin embargo, esto estimuló la investigación que evalúa la densidad de otros tipos de células inmunes (como macrófagos, células dendríticas uterinas) en el endometrio en mujeres con RM10,11. Sin embargo, sigue siendo incierto si existe una alteración significativa en la densidad de células inmunes en el endometrio periimplantacional en mujeres con RM.
Una posible explicación para la incertidumbre es que la evaluación de la densidad de células inmunes endometriales podría ser difícil debido a los rápidos cambios en el endometrio durante la ventana de implantación. Durante el período de 24 h, cambios significativos en el endometrio alteran la densidad celular inmune y la secreción de citoquinas, introduciendo una fuente de variación en estos resultados12. Además, la mayoría de los informes se basan principalmente en el uso de tinción unicelular (por ejemplo, métodos tradicionales de IHC) que no pudieron examinar múltiples marcadores en la misma sección de tejido. Aunque la citometría de flujo se puede utilizar para detectar múltiples poblaciones celulares en una sola muestra, las grandes cantidades de células requeridas y la optimización que consume mucho tiempo dificultan la popularidad y la eficiencia de este método. Por lo tanto, el reciente avance en la tinción multiplex IHC podría resolver este problema mediante la inmunotinción de múltiples marcadores en la misma diapositiva para evaluar múltiples parámetros, incluido el linaje celular y la localización histológica de subpoblaciones inmunes individuales. Además, esta tecnología puede maximizar la información obtenida en caso de disponibilidad limitada de tejido. En última instancia, esta técnica puede ayudar a dilucidar las diferencias en las interacciones de las células inmunes en el endometrio entre las mujeres fértiles y las mujeres con RM.
Dos grupos de mujeres fueron reclutadas del Hospital Príncipe de Gales, incluidas las mujeres de control fértil (FC) y las mujeres con aborto espontáneo recurrente inexplicable (RM). El control fértil se definió como las mujeres que tuvieron al menos un nacimiento vivo sin antecedentes de aborto espontáneo, y las mujeres RM se definieron como aquellas que tenían antecedentes de abortos espontáneos consecutivos ≥2 antes de las 20 semanas de gestación. Los sujetos de los dos grupos cumplieron con los siguientes criterios de inclusión: (a) edad entre 20 y 42 años, (b) no fumador, (c) ciclo menstrual regular (25-35 días) y estructura uterina normal, (d) no uso de ningún régimen hormonal durante al menos 3 meses antes de la biopsia endometrial, (e) no hidrosalpinx por histero-salpingograma. Además, todos los sujetos reclutados tenían cariotipo normal, histerosalpingografía tridimensional normal, hormona estimulante del folículo día 2 30 nmol / L, función tiroidea normal y dieron negativo para anticoagulante lúpico y anticuerpos IgG e IgM anticardiolipina.
Para comprender mejor la base inmunológica de la RM, sería más deseable cuantificar y localizar simultáneamente los principales tipos de células inmunes presentes en el endometrio en el momento de la implantación. Este artículo describe todo el protocolo desde la preparación de la muestra, la optimización multiplex con marcadores para los subtipos de células inmunes y el escaneo de las diapositivas, seguido de un análisis de datos con referencia específica a la detección de células inmunes endometriales. Además, este artículo describe cómo determinar la densidad y la agrupación de los tipos de células inmunes simultáneamente en el endometrio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pasos críticos dentro del protocolo
Es importante tener en cuenta que la tinción multiplex requiere una optimización diligente. La recuperación de antígenos, utilizando tampón de citrato y tecnología de microondas, requiere optimización para garantizar la extracción completa de anticuerpos y mantener la viabilidad del tejido. A medida que los reactivos TSA se unen covalentemente a los sitios que rodean el antígeno, pueden inhibir potencialmente la unión de un anticuerpo primario posterior a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el Fondo Fiduciario Obstétrico y Ginecológico de Hong Kong en 2018 y el Fondo de Salud e Investigación Médica de Hong Kong (06170186, 07180226).
Materials
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
Riferimenti
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