Tekrarlayan Düşükte Dört Endometriyal İmmün Hücre Tipinin Çok Yönlü Floresan İmmünohistokimyasal Boyanması
Summary
Multipleks immünhistokimya ve multispektral görüntülemedeki gelişmelere rağmen, endometriyumda aynı anda majör immün hücrelerin yoğunluğunu ve kümelenişini karakterize etmek bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu makalede, endometriyumdaki dört immün hücre tipinin eşzamanlı lokalizasyonu için ayrıntılı bir multipleks boyama protokolü ve görüntüleme açıklanmaktadır.
Abstract
İmmünohistokimizma, biyolojik araştırma ve klinik tanılarda doku antijenlerinin tanımlanması ve görselleştirilmesinde en sık kullanılan yöntemdir. Yara iyileşmesi, immün yanıt, doku reddi ve doku-biyomalzeme etkileşimleri gibi çeşitli biyolojik süreçleri veya patolojileri karakterize etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, konvansiyonel immünohistokimyasal (IHC) boyama kullanılarak tek bir doku bölümünde birden fazla antijenin (özellikle bağışıklık hücreleri için) görselleştirilmesi ve nicelemesi tatmin edici değildir. Bu nedenle, son yıllarda tek bir doku örneğinde veya farklı doku örneklerinden oluşan bir toplulukta birden fazla biyolojik belirteci tanımlamak için çoklayıcı teknolojiler tanıtıldı.
Bu teknolojiler özellikle implantasyon sırasında tekrarlayan düşükleri olan doğurgan kadınlar ve kadınlar arasında endometriyum içindeki bağışıklık hücresi-hücre etkileşimlerindeki değişiklikleri ayırt etmede yararlı olabilir. Bu makalede, embriyo implantasyonu sırasında tam olarak zamanlanmış endometriyal örneklerde aynı anda dört ana immün hücre tipinin yoğunluğunu ve kümelenmeyi araştırmak için çok faktörlü floresan IHC boyama için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Yöntem, örnek hazırlama, immün hücre alt tipleri için belirteçlerle multipleks optimizasyonu ve endometriyal bağışıklık hücrelerinin tespit edilmesine özel referansla slaytların taranmasını ve ardından veri analizini içerir.
Bu yöntem kullanılarak, endometriyumdaki dört ana immün hücre tipinin yoğunluğu ve kümelenmesi aynı anda tek bir doku bölümünde analiz edilebilir. Buna ek olarak, bu makalede, uygulanan floresan problar arasındaki olası florofor parazitinin üstesinden gelmek için kritik faktörler ve sorun giderme tartışılacaktır. Daha da önemlisi, bu multipleks boyama tekniğinden elde edilen sonuçlar, embriyo implantasyonu sırasında immünolojik etkileşimin ve regülasyonun derinlemesine anlaşılmasına yardımcı olabilir.
Introduction
Tekrarlayan düşük (RM), 24 haftalık gebelik1’denönce iki veya daha fazla gebenin kaybı olarak tanımlanabilir. Bu sık üreme durumu dünya çapında çiftlerin% 1’ini etkiler2,3. Patofizyoloji multifaktöriyeldir ve embriyolojik olarak yönlendirilen nedenlere (esas olarak anormal embriyonik karyotip nedeniyle) ve endometrium ve/veya plasenta gelişimini etkileyen doğum odaklı nedenlere ayrılabilir. Bu tezahür ebeveyn genetik anormallikleri, rahim anomalileri, protropombotik durumlar, endokrinoloji faktörleri ve immünolojik bozukluklardan kaynaklanabilir4.
Son yıllarda, immün efektör hücre disfonksiyonu erken gebelik kaybının patogenezine bulaşmıştır5. Bu, adet döngüsü, implantasyon ve erken gebelik sırasında endometriyumdaki spesifik bağışıklık hücrelerinin popülasyonlarını, erken gebelikte belirli rollerle aydınlatıcı birçok araştırmaya ilham vermiştir. Bu bağışıklık hücreleri arasında, uterus doğal öldürücü (uNK) hücreler embriyo implantasyonu ve gebelik sırasında, özellikle trofoblastik invazyon ve anjiogenez süreçlerinde kritik bir rol oynar6. Çalışmalar RM7,8ile kadınların endometriumunda artan bir uNK hücre yoğunluğu göstermiştir , ancak bu bulgu düşük riskinin artmasıyla ilişkili değildi9. Bununla birlikte, bu RM10,11olan kadınlarda endometriyumdaki diğer bağışıklık hücresi türlerinin (makrofajlar, uterus dendritik hücreler gibi) yoğunluğunu değerlendiren araştırmayı teşvik etti. Bununla birlikte, RM’li kadınlarda peri implantasyon endometriyumunda bağışıklık hücre yoğunluğunda önemli bir değişiklik olup olmadığı belirsizliğini korumaktadır.
Belirsizliğin olası bir açıklaması, implantasyon penceresi sırasında endometriyumdaki hızlı değişiklikler nedeniyle endometriyal immün hücre yoğunluğunun değerlendirilmesinin zor olabileceğidir. 24 saat boyunca, endometriyumdaki önemli değişiklikler bağışıklık hücre yoğunluğunu ve sitokin salgısını değiştirir ve bu sonuçlarda bir varyasyon kaynağı12. Buna ek olarak, çoğu rapor esas olarak aynı doku bölümündeki birden fazla belirteci inceleyemeyen tek hücreli boyamanın (örneğin geleneksel IHC yöntemleri) kullanımına dayanır. Akış sitometrisi tek bir örnekte birden fazla hücre popülasyonunu tespit etmek için kullanılabilse de, gerekli olan büyük miktarda hücre ve zaman alıcı optimizasyon bu yöntemin popülaritesini ve verimliliğini engeller. Bu nedenle, multipleks IHC boyamadaki son gelişme, hücre soyu ve bireysel immün subpopulasyonların histolojik lokalizasyonu da dahil olmak üzere birden fazla parametreyi değerlendirmek için aynı slayttaki birden fazla belirteci immünostaining yaparak bu sorunu çözebilir. Ayrıca, bu teknoloji sınırlı doku kullanılabilirliği durumunda elde edilen bilgileri en üst düzeye çıkarabilir. Sonuçta, bu teknik, doğurgan kadınlar ve RM’li kadınlar arasındaki endometriyumdaki bağışıklık hücresi etkileşimlerindeki farklılıkların aydınlatıcı olmasına yardımcı olabilir.
Prince of Wales Hastanesi’nden doğurgan kontrol kadınları (FC) ve açıklanamayan tekrarlayan düşük (RM) olan kadınlar da dahil olmak üzere iki grup kadın işe alındı. Doğurganlık kontrolü, spontan düşük öyküsü olmadan en az bir canlı doğum yapan kadınlar, RM kadınları ise 20 haftalık gebelikten önce art arda ≥2 düşük öyküsü olanlar olarak tanımlandı. İki gruptan denekler aşağıdaki dahil etme kriterlerini karşılar: (a) 20 ila 42 yaş arası yaş, (b) sigara içmeyen, (c) düzenli adet döngüsü (25-35 gün) ve normal rahim yapısı, (d) Endometriyal biyopsiden önce en az 3 ay hormonal rejim kullanılmaması, (e) histerik-salpingogram ile hidrosalpinks kullanılmaması. Buna ek olarak, işe alınan tüm deneklerde normal karyotiping, normal 3 boyutlu ultrasonografi histerikalpingogram, 2. gün folikül uyarıcı hormon 30 nmol/L, normal tiroid fonksiyonu vardı ve lupus antikoagülan ve antikardiyolinilin IgG ve IgM antikorları için negatif test edildi.
RM’nin immünolojik temelini daha iyi anlamak için, implantasyon sırasında endometriyumda bulunan başlıca immün hücre tiplerinin aynı anda ölçülmesi ve lokalize edilmesi en çok arzu edilir. Bu makalede, numune hazırlamadan tüm protokol, bağışıklık hücresi alt tipleri için belirteçlerle çoklama optimizasyonu ve slaytların taranmasının ardından endometriyal bağışıklık hücrelerinin tespitine özel referanslı veri analizi açıklanmaktadır. Ayrıca, bu makalede endometriyumda aynı anda bağışıklık hücre tiplerinin yoğunluğunun ve kümelenmesi nasıl belirlenecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol içinde kritik adımlar
Multipleks boyamanın gayretli optimizasyon gerektirdiğini belirtmek önemlidir. Sitrat tampon ve mikrodalga teknolojisini kullanan antijen alımı, tam antikor sıyırmasını sağlamak ve doku canlılığını korumak için optimizasyon gerektirir. TSA reaktifleri antijeni çevreleyen bölgelere kovalent olarak bağladıklarından, sterik engel (“şemsiye etkisi” olarak da bilinir) yoluyla sonraki primer antikorun bağlanmasını potansiyel olarak engelleyebilirler….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma 2018 yılında Hong Kong Kadın Hastalıkları ve Doğum Güven Fonu ve Hong Kong Sağlık ve Tıbbi Araştırma Fonu (06170186, 07180226) tarafından desteklendi.
Materials
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
Riferimenti
- ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).
- Stirrat, G. M. Recurrent miscarriage. Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).
- Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
- Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
- King, A. Uterine leukocytes and decidualization. Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).
- Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
- Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
- Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
- Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
- Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
- Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
- Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, 26-36 (1999).
- Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).
