Optogenetische faseovergang van TDP-43 in spinale motorneuronen van zebravislarven
Summary
We beschrijven een protocol om faseovergang van TAR DNA-bindend eiwit 43 (TDP-43) te induceren door licht in de spinale motorneuronen met zebravissen als model.
Abstract
Abnormale eiwitaggregatie en selectieve neuronale kwetsbaarheid zijn twee belangrijke kenmerken van neurodegeneratieve ziekten. Causale relaties tussen deze kenmerken kunnen worden onderzocht door de faseovergang van een ziekte-geassocieerd eiwit in een kwetsbaar celtype te beheersen, hoewel deze experimentele benadering tot nu toe beperkt is geweest. Hier beschrijven we een protocol om faseovergang van het RNA /DNA-bindende eiwit TDP-43 in spinale motorneuronen van zebravislarven te induceren voor het modelleren van cytoplasmatische aggregatie van TDP-43 die optreedt in degenererende motorneuronen bij amyotrofische laterale sclerose (ALS). We beschrijven een bacteriële kunstmatige chromosoom (BAC) -gebaseerde genetische methode om selectief een optogenetische TDP-43-variant af te leveren aan spinale motorneuronen van zebravissen. De hoge doorschijnendheid van zebravislarven zorgt voor de faseovergang van de optogenetische TDP-43 in de spinale motorneuronen door een eenvoudige externe verlichting met behulp van een lichtgevende diode (LED) tegen ongeremde vissen. We presenteren ook een basisworkflow van live beeldvorming van de spinale motorneuronen van de zebravis en beeldanalyse met vrij beschikbare Fiji / ImageJ-software om reacties van de optogenetische TDP-43 op de lichtverlichting te karakteriseren. Dit protocol maakt de karakterisering van TDP-43 faseovergang en geaggregeerde vorming in een ALS-kwetsbare cellulaire omgeving mogelijk, wat een onderzoek naar de cellulaire en gedragsmatige gevolgen ervan zou moeten vergemakkelijken.
Introduction
Ribonucleoproteïne (RNP) korrels regelen een groot aantal cellulaire activiteiten in de kern en het cytoplasma door membraanloze partities te assembleren via vloeistof-vloeistoffasescheiding (LLPS), een fenomeen waarbij een homogene vloeistof zich ontmengt in twee verschillende vloeibare fasen1,2. De ontregelde LLPS van RNA-bindende eiwitten die normaal functioneren als RNP-korrelcomponenten bevorderen abnormale faseovergang, wat leidt tot eiwitaggregatie. Dit proces is betrokken bij neurologische en neurodegeneratieve ziekten3,4,5. De precieze evaluatie van een oorzakelijk verband tussen afwijkende LLPS van RNA-bindende eiwitten en ziektepathogenese is cruciaal om te bepalen of en hoe LLPS kan worden benut als een effectief therapeutisch doelwit. LLPS van RNA-bindende eiwitten is relatief eenvoudig te bestuderen in vitro en in eencellige modellen, maar is moeilijk in meercellige organismen, vooral bij gewervelde dieren. Een kritieke vereiste voor het analyseren van dergelijke LLPS in individuele cellen in een weefselomgeving is om stabiel een sonde uit te drukken voor de beeldvorming en manipulatie van LLPS in een ziektegevoelig celtype van belang.
Amyotrofische laterale sclerose (ALS) is een uiteindelijk fatale neurologische aandoening waarbij motorneuronen van de hersenen en het ruggenmerg selectief en progressief verloren gaan als gevolg van degeneratie. Tot op heden zijn mutaties in meer dan 25 genen geassocieerd met de erfelijke (of familiale) vorm van ALS, die goed is voor 5%-10% van de totale ALS-gevallen, en sommige van deze ALS-veroorzakende genen coderen voor RNA-bindende eiwitten bestaande uit RRP’s, zoals hnRNPA1, TDP-43 en FUS6,7. Bovendien wordt de sporadische vorm van ALS, die goed is voor 90%-95% van de totale ALS-gevallen, gekenmerkt door de cytoplasmatische aggregatie van TDP-43 afgezet in degenererende motorneuronen. Een belangrijk kenmerk van deze ALS-geassocieerde RNA-bindende eiwitten zijn hun intrinsiek ongeordende regio’s (IDR’s) of laagcomplexe domeinen die geordende driedimensionale structuren missen en zwakke eiwit-eiwitinteracties bemiddelen met veel verschillende eiwitten die LLPS7,8 aandrijven. Het feit dat ALS-veroorzakende mutaties vaak voorkomen in de IDR’s heeft geleid tot het idee dat afwijkende LLPS en faseovergang van deze ALS-gerelateerde eiwitten ten grondslag kunnen liggen aan als pathogenese9,10.
Onlangs werd de optoDroplet-methode ontwikkeld, een op Cryptochrome 2 gebaseerde optogenetische techniek die de modulatie van eiwit-eiwitinteracties door licht mogelijk maakt, om faseovergang van eiwitten met IDR’s te induceren11. Aangezien deze techniek met succes is uitgebreid tot TDP-43, is het begonnen met het blootleggen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathologische faseovergang van TDP-43 en de bijbehorende cytotoxiciteit12,13,14,15. In dit protocol schetsen we een genetische methode om een optogenetische TDP-43 af te leveren aan ALS-kwetsbare celtypen, namelijk spinale motorneuronen in zebravissen met behulp van de BAC voor het mnr2b/mnx2b-gen dat codeert voor een homeodomain-eiwit voor motorneuronspecificatie16,17. De hoge doorschijnendheid van zebravislarven zorgt voor eenvoudige, niet-invasieve lichtstimulatie van de optogenetische TDP-43 die de faseovergang in de spinale motorneuronen veroorzaakt. We presenteren ook een basisworkflow voor de live beeldvorming van de spinale motorneuronen van de zebravis en beeldanalyse met behulp van de vrij beschikbare Fiji / ImageJ-software om de reacties van de optogenetische TDP-43 op de lichtstimulatie te karakteriseren. Deze methoden maken een onderzoek mogelijk naar de TDP-43-faseovergang in een ALS-kwetsbare cellulaire omgeving en moeten helpen om de pathologische gevolgen ervan op cellulair en gedragsmatig niveau te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mnr2b-BAC-gemedieerde expressie van opTDP-43h en EGFP-TDP-43z in zebravissen biedt een unieke kans voor live beeldvorming van TDP-43 faseovergang in de spinale motorneuronen. De optische transparantie van lichaamsweefsels van zebravislarven zorgt voor de eenvoudige en niet-invasieve optogenetische stimulatie van opTDP-43h. Vergelijkingen tussen enkele spinale motorneuronen in de loop van de tijd toonden aan dat de lichtafhankelijke oligomerisatie van opTDP-43h de cytoplasmatische clustering veroorzaakt, wat d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant nummers JP19K06933 (KA) en JP20H05345 (KA).
Materials
| Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
| Epifluorescence microscope | ZEISS | Axioimager Z1 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica | MZ16FA | |
| Glass base dish | IWAKI | 3910-035 | |
| Incubator | MEE | CN-25C | |
| LED panel | Nanoleaf Limited | Nanoleaf AURORA smarter kit | |
| Mupid-2plus | TAKARA | AD110 | |
| NucleoBond BAC100 | MACHEREY-NAGEL | 740579 | |
| NuSieve GTG Agarose | LONZA | 50181 | |
| Objective lens | Olympus | XLUMPlanFL N 20×/1.00 | |
| Objective lens | ZEISS | Plan-Neofluar 5x/0.15 | |
| Optical power meter | HIOKI | 3664 | |
| Optical sensor | HIOKI | 9742-10 | |
| Phenol red solution 0.5% | Merck | P0290-100ML | |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | TAKARA | R050A | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Six-well dish | FALCON | 353046 | |
| Spectrometer probe BLUE-Wave | StellerNet Inc. | VIS-50 | |
| Syringe needle | TERUMO | NN-2725R | |
| TaKaRa Ex Taq | TAKARA | RR001A | |
| Tricane | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Zebrafish BAC clone CH211-172N16 | BACPAC Genomics | CH211-172N16 |
Riferimenti
- Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
- Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).
- Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).
- Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders. Cell. 154 (4), 727-736 (2013).
- Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. ALS genes in the genomic era and their implications for FTD. Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).
- Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).
- Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).
- Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).
- Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).
- Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
- Zhang, P., et al. Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology. Elife. 8, 39578 (2019).
- Mann, J. R., et al. RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43. Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).
- Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons. Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).
- Otte, C. G., et al. Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo. Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).
- Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation. Biologia dello sviluppo. 268 (2), 372-383 (2004).
- Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics. Neural Development. 7, 35 (2012).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Research. 33 (4), 36 (2005).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nature Communications. 5, 4925 (2014).
- Asakawa, K., Kawakami, K. Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus. Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).
- Redchuk, T. A., et al. Optogenetic regulation of endogenous proteins. Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).
