Zebrafish लार्वा के स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में TDP-43 के ऑप्टोजेनेटिक चरण संक्रमण
Summary
हम एक मॉडल के रूप में ज़ेब्राफ़िश का उपयोग करके स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में प्रकाश द्वारा टीएआर डीएनए-बाइंडिंग प्रोटीन 43 (टीडीपी -43) के चरण संक्रमण को प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Abstract
असामान्य प्रोटीन एकत्रीकरण और चयनात्मक न्यूरोनल भेद्यता न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के दो प्रमुख लक्षण हैं। इन विशेषताओं के बीच कारण संबंधों को एक कमजोर सेल प्रकार में एक बीमारी से जुड़े प्रोटीन के चरण संक्रमण को नियंत्रित करके पूछताछ की जा सकती है, हालांकि यह प्रयोगात्मक दृष्टिकोण अब तक सीमित है। यहां, हम एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस) में मोटर न्यूरॉन्स को विघटित करने वाले टीडीपी -43 के साइटोप्लाज्मिक एकत्रीकरण के लिए जेब्राफ़िश लार्वा के स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में आरएनए / डीएनए-बाइंडिंग प्रोटीन टीडीपी -43 के चरण संक्रमण को प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम एक जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र (बीएसी) -आधारित आनुवंशिक विधि का वर्णन करते हैं जो ज़ेब्राफ़िश के स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स को चुनिंदा रूप से एक ऑप्टोजेनेटिक टीडीपी -43 संस्करण प्रदान करता है। ज़ेब्राफ़िश लार्वा की उच्च पारभासी अनियंत्रित मछली के खिलाफ एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) का उपयोग करके एक साधारण बाहरी रोशनी द्वारा स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में ऑप्टोजेनेटिक टीडीपी -43 के चरण संक्रमण की अनुमति देती है। हम ज़ेब्राफ़िश स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स के लाइव इमेजिंग का एक बुनियादी वर्कफ़्लो भी प्रस्तुत करते हैं और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध फिजी / इमेजजे सॉफ़्टवेयर के साथ छवि विश्लेषण प्रकाश रोशनी के लिए ऑप्टोजेनेटिक टीडीपी -43 की प्रतिक्रियाओं को चिह्नित करते हैं। यह प्रोटोकॉल टीडीपी -43 चरण संक्रमण के लक्षण वर्णन और एएलएस-कमजोर सेलुलर वातावरण में कुल गठन को सक्षम बनाता है, जो इसके सेलुलर और व्यवहारिक परिणामों की जांच की सुविधा प्रदान करना चाहिए।
Introduction
राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) ग्रैन्यूल्स तरल-तरल चरण पृथक्करण (एलएलपीएस) के माध्यम से झिल्ली-कम विभाजन को इकट्ठा करके नाभिक और साइटोप्लाज्म में सेलुलर गतिविधियों के असंख्य को नियंत्रित करते हैं, एक घटना जिसमें एक सजातीय तरल पदार्थ दो अलग-अलग तरल चरणों में डीमिक्स करता है1,2। आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन के डिस्रेगुलेटेड एलएलपीएस जो आमतौर पर आरएनपी ग्रेन्युल घटकों के रूप में कार्य करते हैं, असामान्य चरण संक्रमण को बढ़ावा देते हैं, जिससे प्रोटीन एकत्रीकरण होता है। इस प्रक्रिया को न्यूरोडेवलपमेंटल और न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों 3,4,5 में फंसाया गया है। आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन और रोग रोगजनन के अनियमित एलएलपीएस के बीच एक कारण संबंध का सटीक मूल्यांकन यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि क्या और कैसे एलएलपीएस को एक प्रभावी चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में शोषण किया जा सकता है। आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन के एलएलपीएस को विट्रो और एककोशिकीय मॉडल में अध्ययन करना अपेक्षाकृत आसान है, लेकिन बहुकोशिकीय जीवों में मुश्किल है, खासकर कशेरुकियों में। एक ऊतक वातावरण के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं में इस तरह के एलएलपीएस का विश्लेषण करने के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता एक रोग-कमजोर सेल प्रकार के ब्याज में एलएलपीएस की इमेजिंग और हेरफेर के लिए एक जांच को स्थिर रूप से व्यक्त करना है।
एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस) एक अंततः घातक न्यूरोलॉजिकल विकार है जिसमें मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के मोटर न्यूरॉन्स चुनिंदा और उत्तरोत्तर अपघटन के कारण खो जाते हैं। आज तक, 25 से अधिक जीनों में उत्परिवर्तन एएलएस के वंशानुगत (या पारिवारिक) रूप से जुड़े हुए हैं, जो कुल एएलएस मामलों के 5% -10% के लिए जिम्मेदार है, और इनमें से कुछ एएलएस-कारण जीन आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन को एन्कोड करते हैं, जिसमें आरएनपी शामिल हैं, जैसे कि एचएनआरएनपीए 1, टीडीपी -43, और एफयूएस 6, 7। इसके अलावा, एएलएस का छिटपुट रूप, जो कुल एएलएस मामलों का 90% -95% है, को टीडीपी -43 के साइटोप्लाज्मिक एकत्रीकरण की विशेषता है जो मोटर न्यूरॉन्स में जमा होता है। इन एएलएस-संबद्ध आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन की एक प्रमुख विशेषता उनके आंतरिक रूप से अव्यवस्थित क्षेत्र (आईडीआर) या कम जटिलता वाले डोमेन हैं जिनमें आदेशित तीन आयामी संरचनाओं की कमी है और कई अलग-अलग प्रोटीनों के साथ कमजोर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की मध्यस्थता करते हैं जो एलएलपीएस 7,8 चलाते हैं। तथ्य यह है कि एएलएस-कारण उत्परिवर्तन अक्सर आईडीआर में होते हैं, इस विचार को जन्म दिया है कि इन एएलएस से संबंधित प्रोटीनों के एलएलपीएस और चरण संक्रमण एएलएस रोगजनन 9,10 को रेखांकित कर सकते हैं।
हाल ही में, ऑप्टोड्रॉपलेट विधि, एक क्रिप्टोक्रोम 2-आधारित ऑप्टोजेनेटिक तकनीक जो प्रकाश द्वारा प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के मॉडुलन की अनुमति देती है, को आईडीआर 11 के साथ प्रोटीन के चरण संक्रमण को प्रेरित करने के लिए विकसित किया गया था। चूंकि इस तकनीक को सफलतापूर्वक टीडीपी -43 तक विस्तारित किया गया है, इसने टीडीपी -43 और इसके संबंधित साइटोटॉक्सिसिटी 12,13,14,15 के पैथोलॉजिकल चरण संक्रमण के अंतर्निहित तंत्र को उजागर करना शुरू कर दिया है। इस प्रोटोकॉल में, हम एएलएस-कमजोर सेल प्रकारों को एक ऑप्टोजेनेटिक टीडीपी -43 देने के लिए एक आनुवंशिक विधि की रूपरेखा तैयार करते हैं, अर्थात्, ज़ेब्राफ़िश में स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स mnr2b / mnx2b जीन के लिए बीएसी का उपयोग करके मोटर न्यूरॉन विनिर्देश 16,17 के लिए एक होमोडोमेन प्रोटीन एन्कोडिंग। ज़ेब्राफ़िश लार्वा की उच्च पारभासी ऑप्टोजेनेटिक टीडीपी -43 के सरल, noninvasive प्रकाश उत्तेजना के लिए अनुमति देता है जो रीढ़ की हड्डी के मोटर न्यूरॉन्स में अपने चरण संक्रमण को ट्रिगर करता है। हम ज़ेब्राफ़िश स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स की लाइव इमेजिंग के लिए एक बुनियादी वर्कफ़्लो भी प्रस्तुत करते हैं और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध फिजी / इमेजजे सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके छवि विश्लेषण प्रकाश उत्तेजना के लिए ऑप्टोजेनेटिक टीडीपी -43 की प्रतिक्रियाओं को चिह्नित करते हैं। ये तरीके एक एएलएस-कमजोर सेलुलर वातावरण में टीडीपी -43 चरण संक्रमण की जांच के लिए अनुमति देते हैं और सेलुलर और व्यवहारिक स्तरों पर इसके रोग संबंधी परिणामों का पता लगाने में मदद करनी चाहिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
ज़ेब्राफ़िश में opTDP-43h और EGFP-TDP-43z की mnr2b-BAC-मध्यस्थता अभिव्यक्ति रीढ़ की हड्डी के मोटर न्यूरॉन्स में TDP-43 चरण संक्रमण की लाइव इमेजिंग के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करती है। ज़ेब्राफ़िश लार्वा के शरीर के ऊतकों ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant Numbers JP19K06933 (KA) और JP20H05345 (KA) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
| Epifluorescence microscope | ZEISS | Axioimager Z1 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica | MZ16FA | |
| Glass base dish | IWAKI | 3910-035 | |
| Incubator | MEE | CN-25C | |
| LED panel | Nanoleaf Limited | Nanoleaf AURORA smarter kit | |
| Mupid-2plus | TAKARA | AD110 | |
| NucleoBond BAC100 | MACHEREY-NAGEL | 740579 | |
| NuSieve GTG Agarose | LONZA | 50181 | |
| Objective lens | Olympus | XLUMPlanFL N 20×/1.00 | |
| Objective lens | ZEISS | Plan-Neofluar 5x/0.15 | |
| Optical power meter | HIOKI | 3664 | |
| Optical sensor | HIOKI | 9742-10 | |
| Phenol red solution 0.5% | Merck | P0290-100ML | |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | TAKARA | R050A | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Six-well dish | FALCON | 353046 | |
| Spectrometer probe BLUE-Wave | StellerNet Inc. | VIS-50 | |
| Syringe needle | TERUMO | NN-2725R | |
| TaKaRa Ex Taq | TAKARA | RR001A | |
| Tricane | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Zebrafish BAC clone CH211-172N16 | BACPAC Genomics | CH211-172N16 |
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