Transizione di fase optogenetica di TDP-43 nei motoneuroni spinali delle larve di zebrafish

Kazuhide Asakawa; Hiroshi Handa; Koichi Kawakami

doi:10.3791/62932

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Articolo metodologico

Transizione di fase optogenetica di TDP-43 nei motoneuroni spinali delle larve di zebrafish

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DOI:

10.3791/62932

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25 febbraio 2022

Kazuhide Asakawa¹ , Hiroshi Handa¹ , Koichi Kawakami²^,³

¹Department of Chemical Biology, Tokyo Medical University, ²Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, ³Department of Genetics, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI)

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un protocollo per indurre la transizione di fase della proteina 43 legante il DNA TAR (TDP-43) dalla luce nei motoneuroni spinali usando zebrafish come modello.

Abstract

L'aggregazione proteica anormale e la vulnerabilità neuronale selettiva sono due dei principali tratti distintivi delle malattie neurodegenerative. Le relazioni causali tra queste caratteristiche possono essere interrogate controllando la transizione di fase di una proteina associata alla malattia in un tipo di cellula vulnerabile, sebbene questo approccio sperimentale sia stato finora limitato. Qui, descriviamo un protocollo per indurre la transizione di fase della proteina legante l'RNA / DNA TDP-43 nei motoneuroni spinali delle larve di zebrafish per modellare l'aggregazione citoplasmatica di TDP-43 che si verifica nei motoneuroni degenerativi nella sclerosi laterale amiotrofica (SLA). Descriviamo un metodo genetico basato sul cromosoma artificiale batterico (BAC) per fornire una variante optogenetica TDP-43 in modo selettivo ai motoneuroni spinali del pesce zebra. L'elevata traslucenza delle larve di zebrafish consente la transizione di fase dell'optogenetico TDP-43 nei motoneuroni spinali mediante una semplice illuminazione esterna utilizzando un diodo a emissione luminosa (LED) contro pesci sfrenati. Presentiamo anche un flusso di lavoro di base di imaging dal vivo dei motoneuroni spinali zebrafish e analisi delle immagini con il software Fiji / ImageJ disponibile gratuitamente per caratterizzare le risposte optogenetiche TDP-43 all'illuminazione della luce. Questo protocollo consente la caratterizzazione della transizione di fase TDP-43 e della formazione di aggregati in un ambiente cellulare vulnerabile alla SLA, che dovrebbe facilitare un'indagine delle sue conseguenze cellulari e comportamentali.

Introduzione

I granuli di ribonucleoproteine (RNP) controllano una miriade di attività cellulari nel nucleo e nel citoplasma assemblando partizioni senza membrana tramite separazione di fase liquido-liquido (LLPS), un fenomeno in cui un fluido omogeneo demixes in due fasi liquide ^distinte1,2. Il LLPS disregolato delle proteine leganti l'RNA che normalmente funzionano come componenti del granulo RNP promuove una transizione di fase anormale, portando all'aggregazione proteica. Questo processo è stato implicato nelle malattie dello sviluppo neurologico e neurodegenerative3,4,5.