Dette papir præsenterer en detaljeret trinvis protokol om, hvordan man bruger et integreret multifunktionelt og brugerprogrammerbart system, der muliggør automatisk flerkanalsbilleddannelse og mekanobiologisk analyse for at belyse mekanofølsomheden af Ja-associeret protein (YAP).
Langsigtet multifunktionel billeddannelse og analyse af levende celler kræver strømlinet, funktionel koordinering af forskellige hardware- og softwareplatforme. Manuel styring af forskelligt udstyr produceret af forskellige producenter er imidlertid arbejdskrævende og tidskrævende, hvilket potentielt reducerer nøjagtigheden, reproducerbarheden og kvaliteten af erhvervede data. Derfor kan et alt-i-et og brugerprogrammerbart system, der muliggør automatisk, multifunktionel og langsigtet billedoptagelse og er kompatibelt med de fleste fluorescerende mikroskopiplatforme, gavne det videnskabelige samfund. Dette papir introducerer de komplette driftsprotokoller for at udnytte et nyt integreret softwaresystem, der består af (1) et hjemmebygget softwareprogram med titlen “Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP)”, som muliggør automatisk multikanals billedanskaffelse og (2) en række kvantitative billeddannelsesanalyse- og celletrækkraftberegningspakker.
Dette integrerede system anvendes til at afsløre det hidtil ukendte forhold mellem den rumlige-tidsmæssige fordeling af mekanofølsomt Ja-associeret protein (YAP) og cellemekanikken, herunder cellespredning og trækkraft, i CRISPR/Cas9-konstruerede humane normale celler (B2B) og lungekræftceller (PC9). Ved at udnytte dette systems evne til flerkanalskontrol og udlæsning viser resultatet: (1) B2B-normale celler og PC9-kræftceller viser et særskilt forhold mellem YAP-ekspression, trækkraft og celledynamik under cellesprednings- og migrationsprocesser; og (2) PC9-kræftceller anvender mærkbare peri-nukleare kræfter på substrater. Sammenfattende præsenterer dette papir en detaljeret trinvis protokol om, hvordan man bruger et integreret brugerprogrammerbart system, der muliggør automatisk multifunktionel billeddannelse og analyse for at belyse YAP-mekanofølsomhed. Disse værktøjer åbner mulighed for detaljerede udforskninger af mangesidet signaldynamik i forbindelse med cellefysiologi og patologi.
Det overordnede mål med denne metode er at muliggøre optisk multifunktionel billeddannelse og analyse af levende celler. Et alt-i-et-billeddannelsesprogram, der muliggør automatisk koordinering af multifunktionelle optoelektroniske enheder, reducerer arbejdskrævende og fejlbehæftede manuelle operationer og er afgørende for forskere at udføre langsigtet levende cellebilleddannelse1,2,3,4. Imidlertid gælder de fleste eksisterende offentlige programmer i det biomedicinske forskningsmiljø enten kun for begrænset optoelektronisk udstyr eller kræver yderligere hardware til koordinering af forskelligt udstyr5,6,7,8,9. For nylig er der udviklet et open source- og softwarebaseret program med titlen “Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP)”, der muliggør flerkanals- og time-lapse-billeddannelse. Baseret på Java-sprog og Application Programming Interface (API) på μManager11,12 blev AMFIP udviklet som et plugin i μManager, der udfører tilpassede Java-scripts for at udføre softwarebaseret kommunikation af flere optoelektroniske hardware- og softwareplatforme, herunder, men ikke begrænset til, dem fra Nikon. Etableringen af AMFIP åbner mulighed for programmerbar og multifunktionel forhør af celleadfærd. Et integreret eksperimentelt og beregningssystem er udviklet i dette papir og kombinerer AMFIP med digital billeddannelsesanalyse og celletrækkraftmikroskopi. Systemet gør det muligt at belyse den særskilte YAP-mekanobiologi i CRISPR/Cas9-konstruerede humane normale B2B (figur 1) og lungekræft PC9 (figur 2) cellelinjer. Systemet giver det videnskabelige samfund en omfattende løsning, der undgår efterspørgslen efter at købe yderligere styreenheder, der muligvis ikke er tilgængelige for og / eller kompatible med alle billeddannelsessystem.
De protokoller, der præsenteres i dette papir, introducerer, hvordan man (1) anvender AMFIP til at udføre automatisk langsigtet billeddannelse for begge CRISPR/Cas9-konstruerede cellelinjer, der udtrykker mNEonGreen2-mærket YAP; og (2) kombinere Fiji ImageJ, MATLAB og Origin til kvantitativ analyse af YAP-nukleart / cytoplasma (N / C) -forhold baseret på deres fluorescerende intensitet (figur 3 og figur 4), cellulært forskydningsfelt (figur 1C og figur 2C) og cellulært trækkraftfelt (figur 1D og figur 2D ). Resultaterne tyder på, at (1) i løbet af de første 10 timer af cellespredning på substrater, der har fysiologisk relevant mekanisk stivhed13,14,15,16,17,18, viser YAP N/C-forholdet mellem enkelte B2B-celler mere mærkbar tidsafhængig variation og udsving sammenlignet med for enkelte PC9-celler (figur 5 og figur 6 ); og (2) PC9-kræftceller genererer mærkbar trækkraft i deres peri-nukleare regioner (figur 7). Det integrerede system og metoder, der er beskrevet i denne protokol, overskrider de specifikke typer celler og optogenetiske molekyler. Forskere kan anvende protokollerne til at tilpasse deres specifikke levende celleforhørseksperimenter og belyse mangesidet signaldynamik i forbindelse med cellefysiologi og patologi.
Billeddannelsesprocessen (trin 6.3) er afgørende for at sikre, at fluorescensbillederne er af tilstrækkelig god kvalitet til at give gyldige kvantificeringsresultater. Z-stack-billederne af fluorescerende protein eller perler skal have et z-område, der er stort nok til at omfatte de fokuserede billeder for alle de Z-positioner, som prøven spænder over. Et andet kritisk trin er at indsamle referencebillederne af fluorescerende perler efter opløsning af cellerne (trin 6.5). Da referencebillederne skal tages på de samme positioner i trin 6.3, bør der ikke induceres nogen relativ forskydning mellem petriskålen, miljøkammeret og mikroskopet. Efterforskerne, der udfører opløsningstrinnet, skal være omhyggelige med at fjerne låget på petriskålen og sikre, at den påførte mekaniske forstyrrelse ikke er stor nok til at ændre skålens placering i miljøkammeret.
Nedenfor findes løsninger til at løse nogle fejl, der kan opstå under eksperimenter. Hvis ingen makro er aktiveret efter at have klikket på Enter i trin 6.4, skyldes det sandsynligvis, at det venstre nederste område af skærmen er optaget af et ikke-Element-vindue. I et sådant tilfælde skal det venstre nederste område af vinduet ryddes, så makroer kan aktiveres i Elements. En anden almindelig fejl er, at lysfeltbillederne ser sorte ud. Dette problem skyldes et utilstrækkeligt tidsinterval mellem erhvervelserne af fluorescens og lysfeltbilleder. Små forsinkelser i fluorescensbilleddannelsens tidstælling kan akkumuleres over tid og forårsage betydelige forsinkelser og forstyrre lysfeltbilleddannelsen. En løsning er at justere varigheden af en billeddannelsescyklus for alle positionerne til at være mindre end (ikke lig med) tidsintervallet mellem starten af på hinanden følgende bevægelser. Denne handling opdaterer tidstællingen og eliminerer den kumulative fejl i begyndelsen af hver billedbehandlingscyklus.
Denne optiske forhørsteknologi understøtter (1) en bred vifte af hardware/software, herunder, men ikke begrænset til, Nikon, (2) forskellige typer validerede hydrogelsystemer, herunder gelatine-, PEG-, Matrigel- og kollagen I-geler, og (3) den programmerbare tilpasning baseret på forskernes forskellige behov. Men hvis nogen af kontrolfunktionerne på nederste niveau ikke er tilgængelige fra et kommercielt mikroskop, bliver tilpasning af funktionerne ved hjælp af AMFIP udfordrende. En anden begrænsning af denne teknik er prøvens rumlige drift i både XY- og fokusplanerne (Z). Selvom denne begrænsning kan overvindes under efterbehandlingen af billederne, er det vigtigt at forbedre autofokusfunktionen for at korrigere prøvernes realtidsdrift. Denne forbedring vil øge gennemstrømningen af billeddannelsesprocessen og reducere den potentielle fejl forårsaget af driften under eksperimenter.
Mekanotransducere, såsom YAP, kan tjene som nye terapeutiske mål for udviklingen af lovende kræftbehandlinger25,26,27. Nye data tyder på, at YAP fremmer spredning og invasion af kræftceller. Mekanik-induceret YAP-translokation fra cytoplasmaet til kernen aktiverer transkriptionen af gener relateret til cellemigration, proliferation, invasion og apoptose, hvilket fører til afvigende celleadfærd28,29,30,31. Dette arbejde havde til formål at undersøge den potentielle sammenhæng mellem YAP N / C-forholdet og cellemekanikken i to typiske humane lungekræft og normale cellelinjer. I løbet af cellespredningsperioden på 10 timer viser PC9-celler lignende YAP-koncentrationer i kernen og cytoplasmaet (figur 3D og figur 5A). B2B-celler viser en højere YAP-koncentration i kernen end i cytoplasmaet (figur 3C og figur 5A). Dette forhold, der blev fundet i det tidlige spredningsstadium, er forskelligt fra størstedelen af de offentliggjorte resultater, der sammenligner YAP-koncentration i kernen mellem normale og kræftceller. Selvom det ikke nødvendigvis er i det tidlige spredningsstadium, viser de fleste offentliggjorte resultater, at YAP er mere koncentreret i kernen af kræftceller end i kernen i normale celler27,28. Kun én undersøgelse af brystkræft rapporterede en undtagelse32, der viser, at YAP er mere koncentreret i cytoplasmaet, hvilket stemmer overens med vores nuværende observationer foretaget i lungekræft PC9-celler. Efter forfatternes bedste overbevisning er dette arbejde det første, der viser et lavere YAP N / C-forhold i en human lungekræftcellelinje. Forfatterne antager, at årsagen til et stabilt YAP N / C-forhold i PC9-celler kan skyldes den lave variation i celle / kernespredningsområdet og trækkraft i PC9-celler i det tidlige spredningsstadium. Dissektionen af de understøttende molekylære mekanismer med lavt YAP N/C-forhold i PC9- og B2B-celler er i gang.
I løbet af de første 10 timers spredning viser disse to cellelinjer et særskilt forhold mellem YAP N / C-forholdet, celletrækkraft og spredningsområde (figur 5). For B2B-celler er et højere YAP N/C-forhold korreleret med et højere celle- og kernespredningsområde (figur 6A,B), hvilket er i overensstemmelse med de rapporterede data for andre normale celler33. Interessant nok, selvom udviklingstendensen i dette forhold generelt findes i alle B2B-celler, der er registreret, findes to forskellige grader (høj og lav) af dette forhold. B2B-celler, der spredes og migrerer samtidigt, viser lavere trækkraft og højere celle- og kernespredningsområde med et højere YAP N / C-forhold (2,05 ± 0,32). For B2B-celler, der spredes og forbliver på samme sted, viser de højere trækkraft og lavere celle- og kernespredningsområde med et lavere YAP N / C-forhold (1,74 ± 0,21). Disse to grader af relationer er demonstreret i de forgrenede spredte datagrupper (figur 6C,D). Som rapporteret i litteraturen har stationære normale celler, såsom embryonale fibroblast NIH 3T3-celler, højere trækkraft end vandrende celler34. De data, der er rapporteret i dette papir, tyder på, at de spredende og ikke-migrerende B2B-celler anvendte højere trækkraft end spredning og migrering af B2B-celler, hvilket sandsynligvis tyder på, at der er behov for høj trækkraft for ikke-migrerende celler til at stabilisere sig på substratet.
Derudover viser disse data, at stationære normale B2B-celler genererer en højere peri-nuklear kraft, mens tidligere forskning udført af andre forskere kun rapporterede højere celletrækkraft genereret i periferien af stationære celler34,35,36,37. Forfatterne mener, at forskellen i den iboende tendens til migration i eksperimenterne kan forårsage disse modstridende resultater. I de offentliggjorte eksperimenter var firkantet mikromønster blevet brugt til at begrænse enkeltceller fra at sprede sig og hæmme migration; om cellerne havde tendens til at migrere vides ikke. Da migrerende celler ofte udviser høj trækkraft i periferien af cellerne38, er det sandsynligt, at celler med tendens til at migrere stadig vil opretholde høj trækkraft i periferien, selvom deres migration er begrænset. I denne nuværende undersøgelse er de stationære celler ikke begrænset af nogen mikromønster, men migrerer ikke, hvilket indikerer, at cellerne har tendens til at opretholde deres ikke-migrerende tilstand. En anden mulighed er, at celleformen defineret af mikromønsteret kan påvirke fordelingen af fokale adhæsioner og trækkraft39. Resultaterne i denne undersøgelse blev genereret uden nogen begrænsende mikromønster og repræsenterer kraftfordelingen af stationære celler i deres oprindelige form.
Efter forfatternes bedste overbevisning rapporterede kun én publikation til dato specifikt fundet af peri-nukleare kræfter i normale celler (museembryonale fibroblaster), potentielt forårsaget af actinhætten, der spænder over kernen40. YAP cytoplasma-til-kerne translokation er korreleret med stigningen i peri-nuklear kraft40. En grundig søgning i den relevante litteratur gav ingen publikationer, der rapporterer om en peri-atomkraft eller actinhætten i kræftceller. En indirekte undersøgelse af melanomkræftceller viste, at actinkanten (en anden peri-nuklear actinorganisation placeret omkring, men ikke dækker kernen) reducerer cellemigrationshastighederne41, hvilket indirekte tyder på eksistensen af en peri-nuklear kraft. Der rapporteres dog ingen direkte eksperimentelle data. I denne undersøgelse fandt forfatterne, at både PC9- og B2B-celler viser peri-nuklear forskydning og trækkraft. Mekanismerne i genereringen af de peri-nukleare kræfter og deres virkninger forbliver kontroversielle. I normale celler blev actinhætten rapporteret at spille en rolle i reguleringen af kernemorfologi og kromatinorganisation42, transmittere mekaniske signaler fra fokale adhæsioner ind i kernen gennem linkere af nukleoskelet og cytoskeletkompleks (LINC)43 og regulering af cellemigration44. Lamin A/C er relateret til dannelsen og forstyrrelsen af actin cap40,41,42,43,44. Rapporten, der hævdede, at actinhætten genererer en peri-atomkraft, overvejede imidlertid ikke den potentielle rolle, som actin-randen40 spiller. I kræftceller letter overekspression af Lamin A dannelsen af en actinkant og begrænser kræftcellemigration. Overekspression af Lamin B reducerer actin fælgdannelse og fremmer migration. Den peri-nukleare kraft kan være involveret i denne proces på grund af eksistensen af peri-nuklear actin-organisation og effekten af Lamin A. Resultaterne af denne undersøgelse viste imidlertid ingen tegn på målte peri-nukleare kræfter eller actinhættens opførsel. Derfor er opdagelsen af peri-nukleare kræfter i PC9-celler i denne nuværende undersøgelse den første rapport, der viser peri-nukleare kræfter og forskydninger i lungekræftceller. Forfatterne undersøger i øjeblikket de molekylære mekanismer og funktioner af peri-nukleare kræfter i CRISPR/Cas9-konstruerede PC9- og B2B-celler.
Ud over det all-optiske mekanobiologiske forhør, der demonstreres i dette papir, kan det integrerede multifunktionelle system anvendes til optisk at undersøge et utal af andre vigtige fysiologiske og patobiologiske signaler i levende systemer. For eksempel har forfatternes laboratorium for nylig etableret flere stabilt transducerede humane kræftcellelinjer, der co-udtrykker tre lysresponsive membranproteiner: membranspændingsindikator QuasAr2 (excitation: 640 nm; emission: 660 nm-740 nm), membranspændingsdepolarisator CheRiff (excitation: 488 nm) og membranspændingshyperpolarisator eNpHR3 (excitation: 590 nm). Disse tre funktionelle proteiner kan aktiveres af spektrum-ortogonale laserlinjer på en krydstalefri måde, hvilket muliggør all-optisk tovejs signalkommunikation (udlæsning og kontrol) af membranelektrofysiologi. Ved hjælp af et integreret opto-elektroniksystem og en manuel patch-klemme har forfatterne valideret den helt optiske kontrol og aflæsning af membranspændingen (Vm) i enkelte humane kræftceller og multicellulære tumorsfæroider. Det helt optiske elektrofysiologiske forhør åbner mulighed for detaljerede udforskninger af tidligere utilgængelig bioelektricitet i kræftceller, hvilket kan hjælpe med at fremme tumorbiologi fra en ny akse.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt støttes økonomisk af Cancer Pilot Award fra UF Health Cancer Center (X. T. og D. S.) og Gatorade Award Start-up Package (XT). Forfatterne sætter stor pris på de intellektuelle diskussioner med og de tekniske støtter fra Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Ji-Hyun Lee (Biostatistik, UF), Dr. Hugh Fan (MAE, UF), Dr. Warren Dixon (MAE, UF), Dr. Ghatu Subhash (MAE, UF), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE, UF), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE, UF), Dr. Scott Banks (MAE, UF), Dr. Matthew Traum (MAE, UF), Dr. David Hahn (University of Arizona), Dr. Weihong Wang (Oracle Corporation), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University) og Nikons supportteam (Dr. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon og Jon Ekman). Forfatterne er dybt taknemmelige for den generøse og effektive støtte fra alle medlemmer af Tangs, Siemanns og Guans forskningslaboratorier og alle medarbejdere på MAE & ECE & Physics & Radiation Oncology Departments, UF.
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-aldrich | 440140 | |
0.05 % Trypsin | Corning | 25-051-CI | |
75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
8 Benchtop Centrifuge | Thermo | 75007210 | |
A1R confocal system | Nikon | HD25 | |
Acetic acid | Sigma-aldrich | 695092 | glacial, ACS reagent, ≥99.7% |
BEAS-2B (B2B) cells | Sigma-aldrich | 95102433 | human epithelial cells from lung tissue |
Carboxylate-Modified Microspheres | Invitrogen | F8797 | |
Culture medium (RPMI-1640) | Gibco | 11875093 | |
Desktop Computer | Dell | 2018 | with Windows 10 operating system |
Environmental chamber TIZB | Tokai Hit | TIZB | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140 | |
Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
Fiji ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | 1.53k | |
Glass-bottom petri dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
HEPES buffered saline | Sigma-aldrich | 51558 | |
Hydrazine hydrate solution | Sigma-aldrich | 53847 | |
IntelliJ IDEA | JetBrains | 2020 | Java development platform |
Java Development Kit | Oracle | 14.0 | |
Kimwipe | Kimtech Science | 3066-05 | |
MATLAB | MathWorks | 2020b | |
Monochrome Camera | FLIR | BFS-U3-70S7M-C | |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-218 | |
N,N′-Methylenebisacrylamide solution | Sigma-aldrich | M1533 | |
NIS-Elements software platform | Nikon | 4.50 | software platform |
Origin | OriginLab | OriginPro 2017 (Learning Edition) | data analysis and graphing software |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
PC9 cells | Sigma-aldrich | 90071810 | human adenocarcinoma cells from lung tissue |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-553S | high-fidelity DNA polymerase |
Scotch tape | Scotch | adhesive tape | |
Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma-aldrich | 05030 | |
Super glue | Gorilla | cyanoacrylate glue | |
Ti2-E inverted microscope | Nikon | MEA54000 | |
TI2-S-SE-E Motorized Stage with Encoder | Nikon | MEC56120 | |
μManager | version 2.0 gamma | open source microscopy software (https://micro-manager.org/) |