यह पेपर एक एकीकृत बहु-कार्यात्मक और उपयोगकर्ता-प्रोग्राम योग्य प्रणाली का उपयोग करने के तरीके पर एक विस्तृत चरणबद्ध प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो स्वचालित बहु-चैनल इमेजिंग और मेचानोबायोलॉजिकल विश्लेषण को हाँ से जुड़े प्रोटीन (वाईएपी) की मेचानो-संवेदनशीलता को स्पष्ट करने में सक्षम बनाता है।
लंबे समय तक बहु-कार्यात्मक इमेजिंग और लाइव कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए विभिन्न हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों के सुव्यवस्थित, कार्यात्मक समन्वय की आवश्यकता होती है। हालांकि, विभिन्न निर्माताओं द्वारा उत्पादित विभिन्न उपकरणों का मैनुअल नियंत्रण श्रम-गहन और समय लेने वाला है, संभावित रूप से अधिग्रहित डेटा की सटीकता, पुनरुत्पादन और गुणवत्ता को कम करता है। इसलिए, एक ऑल-इन-वन और उपयोगकर्ता-प्रोग्राम करने योग्य प्रणाली जो स्वचालित, बहु-कार्यात्मक और दीर्घकालिक छवि अधिग्रहण को सक्षम बनाती है और अधिकांश फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी प्लेटफार्मों के साथ संगत है, वैज्ञानिक समुदाय को लाभ पहुंचा सकती है। यह पेपर एक उपन्यास एकीकृत सॉफ़्टवेयर सिस्टम का उपयोग करने के पूर्ण ऑपरेटिंग प्रोटोकॉल का परिचय देता है जिसमें (1) एक घर-निर्मित सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम होता है, जिसका शीर्षक “स्वचालित बहु-कार्यात्मक एकीकरण कार्यक्रम (AMFIP)” है, जो स्वचालित बहु-चैनल इमेजिंग अधिग्रहण को सक्षम बनाता है, और (2) मात्रात्मक इमेजिंग विश्लेषण और सेल ट्रैक्शन गणना पैकेज का एक सूट।
इस एकीकृत प्रणाली को मेचानो-संवेदनशील हां-संबद्ध प्रोटीन (वाईएपी) के स्थानिक-अस्थायी वितरण और सेल यांत्रिकी के बीच पहले से अज्ञात संबंध को प्रकट करने के लिए लागू किया जाता है, जिसमें सेल प्रसार और कर्षण शामिल है, CRISPR / Cas9-इंजीनियर मानव सामान्य कोशिकाओं (B2B) और फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं (PC9) में। मल्टी-चैनल नियंत्रण और रीडआउट की इस प्रणाली की क्षमता का लाभ उठाते हुए, परिणाम से पता चलता है: (1) बी 2 बी सामान्य कोशिकाएं और पीसी 9 कैंसर कोशिकाएं सेल प्रसार और माइग्रेशन प्रक्रियाओं के दौरान वाईएपी अभिव्यक्ति, कर्षण और सेल गतिशीलता के बीच एक अलग संबंध दिखाती हैं; और (2) PC9 कैंसर कोशिकाएं सब्सट्रेट पर ध्यान देने योग्य पेरी-परमाणु बलों को लागू करती हैं। संक्षेप में, यह पेपर एक एकीकृत उपयोगकर्ता-प्रोग्राम योग्य प्रणाली का उपयोग करने के तरीके पर एक विस्तृत चरणबद्ध प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो स्वचालित बहु-कार्यात्मक इमेजिंग और विश्लेषण को वाईएपी मेचानो-संवेदनशीलता को स्पष्ट करने में सक्षम बनाता है। ये उपकरण सेल फिजियोलॉजी और पैथोलॉजी के संदर्भ में बहुआयामी सिग्नलिंग गतिशीलता के विस्तृत अन्वेषणों की संभावना खोलते हैं।
इस विधि का समग्र लक्ष्य सभी ऑप्टिकल बहु-कार्यात्मक इमेजिंग और जीवित कोशिकाओं के विश्लेषण को सक्षम करना है। एक ऑल-इन-वन इमेजिंग प्रोग्राम जो बहु-कार्यात्मक ऑप्टोइलेक्ट्रॉनिक उपकरणों के स्वचालित समन्वय को सक्षम बनाता है, श्रम-गहन और त्रुटि-प्रवण मैनुअल संचालन को कम करेगा और शोधकर्ताओं के लिए दीर्घकालिक लाइव-सेल इमेजिंग 1,2,3,4 का संचालन करने के लिए आवश्यक है। हालांकि, बायोमेडिकल अनुसंधान समुदाय में अधिकांश मौजूदा सार्वजनिक कार्यक्रम या तो केवल सीमित ऑप्टोइलेक्ट्रॉनिक उपकरणों पर लागू होते हैं या विभिन्न उपकरणों के समन्वय के लिए अतिरिक्त हार्डवेयर की आवश्यकता होती है5,6,7,8,9। हाल ही में, एक ओपन-सोर्स और सॉफ़्टवेयर-आधारित प्रोग्राम विकसित किया गया है, जिसका शीर्षक “स्वचालित बहु-कार्यात्मक एकीकरण कार्यक्रम (AMFIP)” है, जो बहु-चैनल और टाइम-लैप्स इमेजिंग को सक्षम करता है। जावा भाषा और μManager11,12 के एप्लिकेशन प्रोग्रामिंग इंटरफेस (एपीआई) के आधार पर, AMFIP को μManager में एक प्लगइन के रूप में विकसित किया गया था जो कई ऑप्टोइलेक्ट्रॉनिक हार्डवेयर और सॉफ़्टवेयर प्लेटफार्मों के सॉफ़्टवेयर-आधारित संचार को पूरा करने के लिए अनुकूलित जावा स्क्रिप्ट निष्पादित करता है, जिसमें शामिल हैं लेकिन निकॉन से उन तक सीमित नहीं हैं। एएमएफआईपी की स्थापना सेल व्यवहार के प्रोग्राम योग्य और बहु-कार्यात्मक पूछताछ की संभावना खोलती है। इस पेपर में एक एकीकृत प्रयोगात्मक और कम्प्यूटेशनल प्रणाली विकसित की गई है और डिजिटल इमेजिंग विश्लेषण और सेल ट्रैक्शन फोर्स माइक्रोस्कोपी के साथ एएमएफआईपी को जोड़ती है। सिस्टम CRISPR / Cas9-इंजीनियर मानव सामान्य B2B (चित्रा 1) और फेफड़ों के कैंसर PC9 (चित्रा 2) सेल लाइनों में विशिष्ट YAP mechanobiology के स्पष्टीकरण को सक्षम बनाता है। सिस्टम वैज्ञानिक समुदाय को एक व्यापक समाधान प्रदान करता है जो अतिरिक्त नियंत्रण उपकरणों को खरीदने की मांग से बचता है जो प्रत्येक इमेजिंग सिस्टम के लिए उपलब्ध नहीं हो सकते हैं और / या संगत हो सकते हैं।
इस पेपर में प्रस्तुत प्रोटोकॉल परिचय कैसे करें (1) CRISPR / Cas9-इंजीनियर सेल लाइनों के लिए स्वचालित दीर्घकालिक इमेजिंग का संचालन करने के लिए एएमएफआईपी लागू करें जो mNEonGreen2-टैग किए गए YAP को व्यक्त करते हैं; और (2) फिजी इमेजजे, MATLAB, और मूल को YAP परमाणु / साइटोप्लाज्म (एन / सी) अनुपात के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उनके फ्लोरोसेंट तीव्रता (चित्रा 3 और चित्रा 4), सेलुलर विस्थापन क्षेत्र (चित्रा 1 सी और चित्रा 2 सी), और सेलुलर कर्षण क्षेत्र (चित्रा 1 डी और चित्रा 2 डी) के आधार पर जोड़ते हैं, और सेलुलर कर्षण क्षेत्र (चित्रा 1 डी और चित्रा 2 डी) ). परिणाम बताते हैं कि (1) सब्सट्रेट्स पर फैलने वाले सेल के पहले 10 एच के दौरान जिसमें शारीरिक रूप से प्रासंगिक यांत्रिक कठोरता होती है13,14,15,16,17,18, एकल बी 2 बी कोशिकाओं का वाईएपी एन / सी अनुपात एकल पीसी 9 कोशिकाओं की तुलना में अधिक ध्यान देने योग्य समय-निर्भर भिन्नता और उतार-चढ़ाव दिखाता है (चित्रा 5 और चित्रा 6) ); और (2) PC9 कैंसर कोशिकाएं अपने पेरी-न्यूक्लियर क्षेत्रों में ध्यान देने योग्य कर्षण उत्पन्न करती हैं (चित्रा 7)। इस प्रोटोकॉल में वर्णित एकीकृत प्रणाली और तरीके विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं और ऑप्टोजेनेटिक अणुओं को पार करते हैं। शोधकर्ता अपने विशिष्ट लाइव-सेल पूछताछ प्रयोगों को अनुकूलित करने के लिए प्रोटोकॉल लागू कर सकते हैं और सेल फिजियोलॉजी और पैथोलॉजी के संदर्भ में बहुआयामी सिग्नलिंग गतिशीलता को स्पष्ट कर सकते हैं।
इमेजिंग प्रक्रिया (चरण 6.3) यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि प्रतिदीप्ति छवियां वैध परिमाणीकरण परिणाम प्राप्त करने के लिए पर्याप्त रूप से अच्छी गुणवत्ता की हैं। फ्लोरोसेंट प्रोटीन या मोतियों की जेड-स्टैक छवियों में एक जेड-रेंज होनी चाहिए जो सभी जेड-पदों के लिए इन-फोकस छवियों को शामिल करने के लिए पर्याप्त बड़ी है जो नमूना फैलाती है। एक और महत्वपूर्ण कदम कोशिकाओं को भंग करने के बाद फ्लोरोसेंट मोतियों की संदर्भ छवियों को इकट्ठा कर रहा है (चरण 6.5)। क्योंकि संदर्भ छवियों को चरण 6.3 में एक ही स्थिति में लेने की आवश्यकता है, इसलिए पेट्री डिश, पर्यावरण कक्ष और माइक्रोस्कोप के बीच कोई सापेक्ष विस्थापन प्रेरित नहीं किया जाना चाहिए। भंग चरण का प्रदर्शन करने वाले जांचकर्ताओं को पेट्री डिश के ढक्कन को हटाने के लिए सावधान रहना चाहिए और यह सुनिश्चित करना चाहिए कि लागू यांत्रिक गड़बड़ी पर्यावरण कक्ष में पकवान के स्थान को बदलने के लिए पर्याप्त बड़ी नहीं है।
प्रयोगों के दौरान होने वाली कुछ त्रुटियों को हल करने के लिए समाधान नीचे दिए गए हैं। यदि चरण 6.4 में Enter पर क्लिक करने के बाद कोई मैक्रो सक्रिय नहीं है, तो यह सबसे अधिक संभावना है क्योंकि स्क्रीन का बायाँ निचला क्षेत्र एक गैर-तत्व विंडो द्वारा कब्जा कर लिया गया है। ऐसे मामले में, विंडो के बाएं नीचे के क्षेत्र को साफ़ करने की आवश्यकता होती है ताकि मैक्रोज़ को तत्वों में सक्रिय किया जा सके। एक और सामान्य त्रुटि यह है कि उज्ज्वल-फ़ील्ड छवियां काली दिखाई देती हैं। यह समस्या प्रतिदीप्ति और उज्ज्वल-फ़ील्ड छवियों के अधिग्रहण के बीच एक अपर्याप्त समय अंतराल के कारण होती है। प्रतिदीप्ति इमेजिंग समय की गिनती में मामूली देरी समय के साथ जमा हो सकती है और काफी देरी का कारण बन सकती है और उज्ज्वल-क्षेत्र इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकती है। एक समाधान सभी पदों के एक इमेजिंग चक्र की अवधि को समायोजित करना है जो लगातार गति की शुरुआत के बीच के समय अंतराल से कम (बराबर नहीं) है। यह कार्रवाई समय की गणना को ताज़ा करती है और प्रत्येक इमेजिंग चक्र की शुरुआत में संचयी त्रुटि को समाप्त करती है।
यह ऑल-ऑप्टिकल पूछताछ तकनीक (1) हार्डवेयर / सॉफ़्टवेयर की एक विस्तृत श्रृंखला का समर्थन करती है, जिसमें निकॉन तक सीमित नहीं है, (2) जिलेटिन, पीईजी, मैट्रिगेल और कोलेजन आई जैल सहित विभिन्न प्रकार के मान्य हाइड्रोजेल सिस्टम, और (3) शोधकर्ताओं की विभिन्न जरूरतों के आधार पर प्रोग्राम योग्य अनुकूलन। हालांकि, यदि किसी भी निचले स्तर के नियंत्रण फ़ंक्शन वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप से उपलब्ध नहीं हैं, तो AMFIP का उपयोग करके फ़ंक्शन का अनुकूलन चुनौतीपूर्ण हो जाता है। इस तकनीक की एक और सीमा XY और फोकस (Z) विमानों दोनों में नमूने का स्थानिक बहाव है। यद्यपि छवियों के पोस्ट-प्रोसेसिंग के दौरान इस सीमा को दूर किया जा सकता है, लेकिन नमूनों के वास्तविक समय के बहाव को सही करने के लिए ऑटो-फोकस फ़ंक्शन में सुधार करना आवश्यक है। यह सुधार इमेजिंग प्रक्रिया के थ्रूपुट को बढ़ाएगा और प्रयोगों के दौरान बहाव के कारण संभावित त्रुटि को कम करेगा।
Mechanotransducers, जैसे YAP, होनहार कैंसर उपचार 25,26,27 के विकास के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में काम कर सकते हैं। उभरते हुए आंकड़ों से पता चलता है कि वाईएपी कैंसर कोशिकाओं के प्रसार और आक्रमण को बढ़ावा देता है। साइटोप्लाज्म से नाभिक में यांत्रिकी-प्रेरित वाईएपी ट्रांसलोकेशन सेल माइग्रेशन, प्रसार, आक्रमण और एपोप्टोसिस से संबंधित जीन के प्रतिलेखन को सक्रिय करता है, जिससे सेल व्यवहार 28,29,30,31 हो जाता है। इस काम का उद्देश्य दो विशिष्ट मानव फेफड़ों के कैंसर और सामान्य सेल लाइनों में वाईएपी एन / सी अनुपात और सेल यांत्रिकी के संभावित सहसंबंध का पता लगाना था। 10 एच सेल प्रसार अवधि के दौरान, PC9 कोशिकाएं नाभिक और साइटोप्लाज्म (चित्रा 3 डी और चित्रा 5 ए) में समान वाईएपी सांद्रता दिखाती हैं। बी 2 बी कोशिकाएं साइटोप्लाज्म (चित्रा 3 सी और चित्रा 5 ए) की तुलना में नाभिक में एक उच्च वाईएपी एकाग्रता दिखाती हैं। प्रारंभिक प्रसार चरण के दौरान पाया जाने वाला यह संबंध प्रकाशित निष्कर्षों के बहुमत से अलग है जो सामान्य और कैंसर कोशिकाओं के बीच नाभिक में वाईएपी एकाग्रता की तुलना करते हैं। हालांकि जरूरी नहीं कि शुरुआती प्रसार चरण में, अधिकांश प्रकाशित निष्कर्षों से पता चलता है कि वाईएपी सामान्य कोशिकाओं के नाभिक की तुलना में कैंसर कोशिकाओं के नाभिक में अधिक केंद्रित है27,28। स्तन कैंसर पर केवल एक अध्ययन ने एक अपवाद 32 की सूचना दी जो दिखाती है कि वाईएपी साइटोप्लाज्म में अधिक केंद्रित है, जो फेफड़ों के कैंसर पीसी 9 कोशिकाओं में किए गए हमारे वर्तमान अवलोकनों से सहमत है। लेखकों के सर्वोत्तम ज्ञान के लिए, यह काम मानव फेफड़ों के कैंसर सेल लाइन में कम वाईएपी एन / सी अनुपात दिखाने वाला पहला है। लेखकों ने परिकल्पना की है कि PC9 कोशिकाओं में एक स्थिर YAP N / C अनुपात का कारण सेल / नाभिक प्रसार क्षेत्र में कम भिन्नता और प्रारंभिक प्रसार चरण में PC9 कोशिकाओं में कर्षण के कारण हो सकता है। PC9 और B2B कोशिकाओं में कम YAP N/C अनुपात के आणविक तंत्र को रेखांकित करने का विच्छेदन चल रहा है।
फैलने के पहले 10 घंटे के दौरान, ये दो सेल लाइनें वाईएपी एन / सी अनुपात, सेल कर्षण और प्रसार क्षेत्र (चित्रा 5) के बीच एक अलग संबंध दिखाती हैं। B2B कोशिकाओं के लिए, एक उच्च YAP N/C अनुपात एक उच्च सेल और नाभिक प्रसार क्षेत्र (चित्रा 6A, B) के साथ सहसंबद्ध है, जो अन्य सामान्य कोशिकाओं के रिपोर्ट किए गए डेटा के अनुरूप है33। दिलचस्प बात यह है कि, हालांकि इस रिश्ते की विकासात्मक प्रवृत्ति आमतौर पर दर्ज सभी बी 2 बी कोशिकाओं में पाई जाती है, इस संबंध के दो अलग-अलग डिग्री (उच्च और निम्न) पाए जाते हैं। बी 2 बी कोशिकाएं जो एक साथ फैलती हैं और प्रवास करती हैं, वे उच्च वाईएपी एन / सी अनुपात (2.05 ± 0.32) के साथ कम कर्षण और उच्च कोशिका और नाभिक प्रसार क्षेत्र दिखाती हैं। बी 2 बी कोशिकाओं के लिए जो एक ही स्थान पर फैलते हैं और रहते हैं, वे कम वाईएपी एन / सी अनुपात (1.74 ± 0.21) के साथ उच्च कर्षण और कम सेल और नाभिक प्रसार क्षेत्र दिखाते हैं। रिश्तों की इन दो डिग्री विभाजित बिखरे हुए डेटा समूहों (चित्रा 6 सी, डी) में प्रदर्शित की जाती हैं। जैसा कि साहित्य में बताया गया है, स्थिर सामान्य कोशिकाएं, जैसे कि भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट एनआईएच 3टी 3 कोशिकाएं, प्रवासी कोशिकाओं की तुलना में अधिक कर्षण होती हैं। इस पेपर में रिपोर्ट किए गए डेटा से पता चलता है कि प्रसार और गैर-माइग्रेटिंग बी 2 बी कोशिकाओं ने बी 2 बी कोशिकाओं को फैलाने और माइग्रेट करने की तुलना में उच्च कर्षण लागू किया, संभवतः यह सुझाव देते हुए कि सब्सट्रेट पर स्थिर होने के लिए गैर-माइग्रेटिंग कोशिकाओं के लिए उच्च कर्षण की आवश्यकता होती है।
इसके अलावा, इन आंकड़ों से पता चलता है कि स्थिर सामान्य बी 2 बी कोशिकाएं एक उच्च पेरी-परमाणु बल उत्पन्न करती हैं, जबकि अन्य शोधकर्ताओं द्वारा किए गए पिछले शोध ने स्थिर कोशिकाओं की परिधि में उत्पन्न केवल उच्च सेल कर्षण की सूचना दी 34,35,36,37। लेखकों का मानना है कि प्रयोगों में प्रवास की आंतरिक प्रवृत्ति में अंतर इन विरोधाभासी परिणामों का कारण बन सकता है। प्रकाशित प्रयोगों में, वर्ग के आकार के माइक्रोपैटर्निंग का उपयोग एकल कोशिकाओं को फैलने और प्रवास को रोकने से रोकने के लिए किया गया था; क्या कोशिकाओं को माइग्रेट करने की प्रवृत्ति थी, यह अज्ञात है। जैसा कि प्रवासी कोशिकाएं अक्सर कोशिकाओं की परिधि पर उच्च कर्षण बल दिखाती हैं38, यह संभावना है कि प्रवास करने की प्रवृत्ति वाली कोशिकाएं अभी भी उच्च परिधि कर्षण बनाए रखेंगी, भले ही उनका प्रवास प्रतिबंधित हो। इस वर्तमान अध्ययन में, स्थिर कोशिकाओं को किसी भी माइक्रोपैटर्न द्वारा प्रतिबंधित नहीं किया जाता है, लेकिन माइग्रेट नहीं होता है, यह दर्शाता है कि कोशिकाएं अपने गैर-माइग्रेटिंग राज्य को बनाए रखती हैं। एक और संभावना यह है कि माइक्रोपैटर्न द्वारा परिभाषित सेल आकार फोकल आसंजन और कर्षण बलों के वितरण को प्रभावित कर सकता है39। इस अध्ययन में परिणाम किसी भी सीमित माइक्रोपैटर्निंग के बिना उत्पन्न किए गए थे और उनके मूल आकार में स्थिर कोशिकाओं के बल वितरण का प्रतिनिधित्व करते हैं।
लेखकों के ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, आज तक केवल एक प्रकाशन ने विशेष रूप से सामान्य कोशिकाओं (माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट्स) में पेरी-परमाणु बलों की खोज की सूचना दी, संभावित रूप से नाभिक 40 में फैले एक्टिन कैप के कारण। YAP साइटोप्लाज्म-टू-न्यूक्लियस ट्रांसलोकेशन पेरी-न्यूक्लियर फोर्स 40 में वृद्धि के साथ सहसंबद्ध है। प्रासंगिक साहित्य की पूरी तरह से खोज ने किसी भी प्रकाशन को प्राप्त नहीं किया जो कैंसर कोशिकाओं में एक पेरी-न्यूक्लियर बल या एक्टिन कैप की रिपोर्ट करता है। मेलेनोमा कैंसर कोशिकाओं पर एक अप्रत्यक्ष अध्ययन से पता चला है कि एक्टिन रिम (एक और पेरी-न्यूक्लियर एक्टिन संगठन जो चारों ओर स्थित है लेकिन नाभिक को कवर नहीं करता है) सेल माइग्रेशन दर 41 को कम करता है, अप्रत्यक्ष रूप से एक पेरी-न्यूक्लियर बल के अस्तित्व का सुझाव देता है। हालांकि, कोई प्रत्यक्ष प्रयोगात्मक डेटा रिपोर्ट नहीं किया गया है। इस अध्ययन में, लेखकों ने पाया कि PC9 और B2B दोनों कोशिकाएं पेरी-न्यूक्लियर विस्थापन और कर्षण दिखाती हैं। पेरी-न्यूक्लियर बलों की पीढ़ी के तंत्र और उनके प्रभाव विवादास्पद बने हुए हैं। सामान्य कोशिकाओं में, एक्टिन कैप को नाभिक आकृति विज्ञान और क्रोमैटिन संगठन 42 को विनियमित करने में भूमिका निभाने की सूचना दी गई थी, जो न्यूक्लियोस्केलेटन और साइटोस्केलेटन (LINC) कॉम्प्लेक्स 43 के लिंकर्स के माध्यम से नाभिक में फोकल आसंजन से यांत्रिक संकेतों को प्रसारित करता है, और सेल माइग्रेशन 44 को विनियमित करता है। लैमिन ए / सी एक्टिन कैप 40,41,42,43,44 के गठन और व्यवधान से संबंधित है। हालांकि, रिपोर्ट जिसमें दावा किया गया है कि एक्टिन कैप एक पेरी-न्यूक्लियर फोर्स उत्पन्न करता है, ने एक्टिन रिम 40 की संभावित भूमिका पर विचार नहीं किया। कैंसर कोशिकाओं में, लैमिन ए का ओवरएक्सप्रेशन एक एक्टिन रिम के गठन की सुविधा प्रदान करता है और कैंसर सेल माइग्रेशन को प्रतिबंधित करता है। लैमिन बी का ओवरएक्सप्रेशन एक्टिन रिम गठन को कम करता है और माइग्रेशन को बढ़ावा देता है। पेरी-न्यूक्लियर फोर्स पेरी-न्यूक्लियर एक्टिन संगठन के अस्तित्व और लैमिन ए के प्रभाव के कारण इस प्रक्रिया में शामिल हो सकता है। हालांकि, इस अध्ययन के परिणामों ने मापा पेरी-परमाणु बलों या एक्टिन कैप के व्यवहार का कोई सबूत नहीं दिखाया। इसलिए, इस वर्तमान अध्ययन में पीसी 9 कोशिकाओं में पेरी-न्यूक्लियर बलों की खोज पहली रिपोर्ट है जो फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं में पेरी-न्यूक्लियर बलों और विस्थापन को दिखाती है। लेखक वर्तमान में CRISPR / Cas9-इंजीनियर PC9 और B2B कोशिकाओं में पेरी-परमाणु बलों के आणविक तंत्र और कार्यों की जांच कर रहे हैं।
इस पेपर में प्रदर्शित सभी ऑप्टिकल मेचानोबायोलॉजी पूछताछ से परे, एकीकृत बहु-कार्यात्मक प्रणाली को जीवित प्रणालियों में अन्य आवश्यक शारीरिक और पैथोबायोलॉजिकल संकेतों के असंख्य ऑप्टिकल रूप से जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, लेखकों की प्रयोगशाला ने हाल ही में कई स्थिर रूप से ट्रांसड्यूस्ड मानव कैंसर सेल लाइनों की स्थापना की है जो तीन प्रकाश-उत्तरदायी झिल्ली प्रोटीन को सह-व्यक्त करते हैं: झिल्ली वोल्टेज संकेतक QuasAr2 (उत्तेजना: 640 एनएम; उत्सर्जन: 660 एनएम -740 एनएम), झिल्ली वोल्टेज विध्रुवीकरण CheRiff (उत्तेजना: 488 एनएम), और झिल्ली वोल्टेज हाइपरपोलराइज़र eNpHR3 (उत्तेजना: 590 एनएम)। इन तीन कार्यात्मक प्रोटीनों को एक क्रॉसस्टॉक-मुक्त तरीके से स्पेक्ट्रम-ऑर्थोगोनल लेजर लाइनों द्वारा सक्रिय किया जा सकता है, जिससे झिल्ली इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के ऑल-ऑप्टिकल दो-तरफा सिग्नलिंग संचार (रीडआउट और नियंत्रण) सक्षम हो सकते हैं। एक एकीकृत ऑप्टो-इलेक्ट्रॉनिक्स सिस्टम और एक मैनुअल पैच-क्लैंप का उपयोग करते हुए, लेखकों ने एकल मानव कैंसर कोशिकाओं और बहुकोशिकीय ट्यूमर गोलाकार में झिल्ली वोल्टेज (वीएम) के सभी ऑप्टिकल नियंत्रण और रीडआउट को मान्य किया है। ऑल-ऑप्टिकल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पूछताछ कैंसर कोशिकाओं में पहले से दुर्गम बायोइलेक्ट्रिकिटी के विस्तृत अन्वेषणों की संभावना खोलती है, जो एक नई धुरी से ट्यूमर जीव विज्ञान को आगे बढ़ाने में मदद कर सकती है।
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना को वित्तीय रूप से यूएफ हेल्थ कैंसर सेंटर (एक्स. टी. और डी. एस.) और गेटोरेड अवार्ड स्टार्ट-अप पैकेज (एक्स. टी.) से कैंसर पायलट अवार्ड द्वारा समर्थित किया जाता है। लेखकों ने ईमानदारी से बौद्धिक चर्चाओं और डॉ जोनाथन लिच (यूएफएचसीसी), डॉ रोल्फ रेने (यूएफएएचसी), डॉ जी-ह्यून ली (बायोस्टैटिस्टिक्स, यूएफ), डॉ ह्यूग फैन (एमएई, यूएफ), डॉ वॉरेन डिक्सन (एमएई, यूएफ), डॉ घाटू सुभाष (एमएई, यूएफ), डॉ मार्क शेपलैक (एमएई और ईसीई, यूएफ), डॉ मलिसा सरनटिनोरेनोंट (एमएई, एमएई), डॉ मलिसा सरनटिनोरेनोंट (एमएई) से तकनीकी सहायता की सराहना की है। यूएफ), डॉ मैथ्यू ट्राम (एमएई, यूएफ), डॉ डेविड हान (एरिज़ोना विश्वविद्यालय), डॉ वेइहोंग वांग (ओरेकल कॉर्पोरेशन), डॉ यूहुआ टैन (हांगकांग पॉलिटेक्निक विश्वविद्यालय), और निकॉन की सहायता टीम (डॉ जोस सेरानो-वेलेज़, लैरी कोर्डन, और जॉन एकमैन)। लेखक तांग, सीमैन और गुआन की अनुसंधान प्रयोगशालाओं के सभी सदस्यों और एमएई और ईसीई और भौतिकी और विकिरण ऑन्कोलॉजी विभागों, यूएफ के सभी कर्मचारियों के सदस्यों से उदार और प्रभावी समर्थन के लिए गहराई से आभारी हैं।
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-aldrich | 440140 | |
0.05 % Trypsin | Corning | 25-051-CI | |
75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
8 Benchtop Centrifuge | Thermo | 75007210 | |
A1R confocal system | Nikon | HD25 | |
Acetic acid | Sigma-aldrich | 695092 | glacial, ACS reagent, ≥99.7% |
BEAS-2B (B2B) cells | Sigma-aldrich | 95102433 | human epithelial cells from lung tissue |
Carboxylate-Modified Microspheres | Invitrogen | F8797 | |
Culture medium (RPMI-1640) | Gibco | 11875093 | |
Desktop Computer | Dell | 2018 | with Windows 10 operating system |
Environmental chamber TIZB | Tokai Hit | TIZB | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140 | |
Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
Fiji ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | 1.53k | |
Glass-bottom petri dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
HEPES buffered saline | Sigma-aldrich | 51558 | |
Hydrazine hydrate solution | Sigma-aldrich | 53847 | |
IntelliJ IDEA | JetBrains | 2020 | Java development platform |
Java Development Kit | Oracle | 14.0 | |
Kimwipe | Kimtech Science | 3066-05 | |
MATLAB | MathWorks | 2020b | |
Monochrome Camera | FLIR | BFS-U3-70S7M-C | |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-218 | |
N,N′-Methylenebisacrylamide solution | Sigma-aldrich | M1533 | |
NIS-Elements software platform | Nikon | 4.50 | software platform |
Origin | OriginLab | OriginPro 2017 (Learning Edition) | data analysis and graphing software |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
PC9 cells | Sigma-aldrich | 90071810 | human adenocarcinoma cells from lung tissue |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-553S | high-fidelity DNA polymerase |
Scotch tape | Scotch | adhesive tape | |
Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma-aldrich | 05030 | |
Super glue | Gorilla | cyanoacrylate glue | |
Ti2-E inverted microscope | Nikon | MEA54000 | |
TI2-S-SE-E Motorized Stage with Encoder | Nikon | MEC56120 | |
μManager | version 2.0 gamma | open source microscopy software (https://micro-manager.org/) |