Dette dokumentet presenterer en detaljert trinnvis protokoll om hvordan du bruker et integrert multifunksjonelt og brukerprogrammerbart system som muliggjør automatisk flerkanals avbildning og mekanobiologisk analyse for å belyse mekano-følsomheten til Ja-assosiert protein (YAP).
Langsiktig multifunksjonell avbildning og analyse av levende celler krever strømlinjeformet, funksjonell koordinering av ulike maskinvare- og programvareplattformer. Manuell kontroll av ulike utstyr produsert av forskjellige produsenter er imidlertid arbeidskrevende og tidkrevende, noe som potensielt reduserer nøyaktigheten, reproduserbarheten og kvaliteten på innsamvede data. Derfor kan et alt-i-ett- og brukerprogrammerbart system som muliggjør automatisk, multifunksjonelt og langsiktig bildeanskaffelse og er kompatibelt med de fleste fluorescerende mikroskopiplattformer, være til nytte for det vitenskapelige samfunnet. Dette dokumentet introduserer de komplette driftsprotokollene for bruk av et nytt integrert programvaresystem som består av (1) et hjemmebygd program, med tittelen “Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP),” som muliggjør automatisk flerkanals bildeinnsamling, og (2) en pakke med kvantitativ bildeanalyse og celletraksjonsberegningspakker.
Dette integrerte systemet brukes for å avdekke det tidligere ukjente forholdet mellom romlig-temporal fordeling av mekano-sensitive Ja-assosierte proteiner (YAP) og cellemekanikken, inkludert cellespredning og trekkraft, i CRISPR/Cas9-konstruerte humane normale celler (B2B) og lungekreftceller (PC9). Ved å utnytte dette systemets evne til flerkanalskontroll og avlesning, viser resultatet: (1) B2B normale celler og PC9 kreftceller viser en tydelig sammenheng mellom YAP-uttrykk, trekkraft og celledynamikk under cellesprednings- og migreringsprosesser; og (2) PC9 kreftceller bruker merkbare peri-nukleære krefter på substrater. Oppsummert presenterer dette dokumentet en detaljert trinnvis protokoll om hvordan du bruker et integrert brukerprogrammerbart system som muliggjør automatisk multifunksjonell avbildning og analyse for å belyse YAP-mekano-følsomhet. Disse verktøyene åpner muligheten for detaljerte undersøkelser av mangefasettert signaldynamikk i sammenheng med cellefysiologi og patologi.
Det overordnede målet med denne metoden er å muliggjøre alloptisk multifunksjonell avbildning og analyse av levende celler. Et alt-i-ett-bildebehandlingsprogram som muliggjør automatisk koordinering av multifunksjonelle optoelektroniske enheter, vil redusere arbeidsintensive og feilutsatte manuelle operasjoner og er avgjørende for at forskere skal kunne utføre langsiktig live-celleavbildning1,2,3,4. Imidlertid gjelder de fleste eksisterende offentlige programmer i det biomedisinske forskningssamfunnet enten bare for begrensede optoelektroniske enheter eller krever ekstra maskinvare for koordinering av forskjellig utstyr5,6,7,8,9. Nylig har et åpen kildekode- og programvarebasert program blitt utviklet, med tittelen “Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP),” som muliggjør flerkanals og tidsforløpavbildning. Basert på Java-språk og Application Programming Interface (API) til μManager11,12, ble AMFIP utviklet som et plugin i μManager som utfører tilpassede Java-skript for å oppnå programvarebasert kommunikasjon av flere optoelektroniske maskinvare- og programvareplattformer, inkludert, men ikke begrenset til, de fra Nikon. Etableringen av AMFIP åpner muligheten for programmerbar og multifunksjonell avhør av celleatferd. Et integrert eksperimentelt og beregningssystem er utviklet i dette dokumentet og kombinerer AMFIP med digital bildeanalyse og celletraksjonskraftmikroskopi. Systemet muliggjør belysning av den distinkte YAP-mekanobiologien i CRISPR/Cas9-konstruerte humane normale B2B-cellelinjer (figur 1) og lungekreft-PC9-cellelinjer (figur 2). Systemet gir det vitenskapelige samfunnet en omfattende løsning som unngår etterspørselen etter å kjøpe ekstra kontrollerende enheter som kanskje ikke er tilgjengelige for og / eller kompatible med hvert bildebehandlingssystem.
Protokollene som presenteres i dette dokumentet, introduserer hvordan du (1) bruker AMFIP til å utføre automatisk langtidsavbildning for både CRISPR/Cas9-konstruerte cellelinjer som uttrykker mNEonGreen2-kodet YAP; og (2) kombinere Fiji ImageJ, MATLAB og Origin for kvantitativ analyse av YAP kjernefysisk/ cytoplasma (N / C) forholdet basert på deres fluorescerende intensitet (figur 3 og figur 4), cellulær forskyvning felt (figur 1C og figur 2C), og cellulær trekkraft felt (figur 1D og figur 2D ). Resultatene tyder på at (1) i løpet av de første 10 t med cellespredning på underlagene som har fysiologisk relevant mekanisk stivhet13,14,15,16,17,18, viser YAP N/C-forholdet mellom enkelt B2B-celler mer merkbar tidsavhengig variasjon og svingning sammenlignet med enkelt-PC9-celler (figur 5 og figur 6 ); og (2) PC9 kreftceller genererer merkbar trekkraft i peri-nukleære regioner (figur 7). Det integrerte systemet og metodene beskrevet i denne protokollen overskrider de spesifikke typer celler og optogenetiske molekyler. Forskere kan anvende protokollene til å tilpasse sine spesifikke live-celle forhørseksperimenter og belyse mangefasettert signaldynamikk i sammenheng med cellefysiologi og patologi.
Avbildningsprosessen (trinn 6.3) er avgjørende for å sikre at fluorescensbildene er av tilstrekkelig god kvalitet til å gi gyldige kvantifiseringsresultater. Z-stack-bildene av fluorescerende protein eller perler bør ha et z-område som er stort nok til å inkludere bilder i fokus for alle Z-posisjonene som prøven spenner over. Et annet kritisk trinn er å samle referansebildene av fluorescerende perler etter oppløsning av cellene (trinn 6.5). Fordi referansebildene må tas i samme posisjon i trinn 6.3, bør ingen relativ forskyvning induseres mellom Petri-parabolen, miljøkammeret og mikroskopet. Etterforskerne som utfører oppløsningstrinnet må være forsiktige med å fjerne lokket på Petri-parabolen og sørge for at den påførte mekaniske perturbasjonen ikke er stor nok til å endre plasseringen av parabolen i miljøkammeret.
Løsningene finner du nedenfor for å løse noen feil som kan oppstå under eksperimenter. Hvis ingen makro er aktivert etter at du har klikket Enter i trinn 6.4, er det mest sannsynlig fordi det venstre nederste området på skjermen er opptatt av et ikke-elementvindu. I slike tilfeller må venstre bunnområde av vinduet fjernes slik at makroer kan aktiveres i Elements. En annen vanlig feil er at lysfeltbildene ser svarte ut. Dette problemet skyldes et utilstrekkelig tidsintervall mellom oppkjøp av fluorescens og lysfeltbilder. Små forsinkelser i antall fluorescensavbildninger kan akkumuleres over tid og forårsake betydelige forsinkelser og forstyrre lysfeltavbildningen. En løsning er å justere varigheten av en bildesyklus for alle posisjonene slik at den er mindre enn (ikke lik) tidsintervallet mellom starten av påfølgende bevegelser. Denne operasjonen oppdaterer tidstellingen og eliminerer den kumulative feilen i begynnelsen av hver bildesyklus.
Denne alloptiske forhørsteknologien støtter (1) et bredt spekter av maskinvare/programvare, inkludert, men ikke begrenset til Nikon, (2) forskjellige typer validerte hydrogelsystemer, inkludert gelatin, PEG, Matrigel og kollagen I geler, og (3) programmerbar tilpasning basert på ulike behov fra forskere. Imidlertid, hvis noen av kontrollfunksjonene på nederste nivå ikke er tilgjengelige fra et kommersielt mikroskop, blir tilpasning av funksjonene ved hjelp av AMFIP utfordrende. En annen begrensning ved denne teknikken er den romlige driften av prøven i både XY- og focus (Z)-planene. Selv om denne begrensningen kan overvinnes under etterbehandling av bildene, er det viktig å forbedre autofokusfunksjonen for å korrigere sanntidsdriften til prøvene. Denne forbedringen vil øke gjennomstrømningen til bildebehandlingsprosessen og redusere den potensielle feilen forårsaket av driften under eksperimenter.
Mechanotransducers, som YAP, kan tjene som nye terapeutiske mål for utvikling av lovende kreftbehandlinger25,26,27. Nye data tyder på at YAP fremmer spredning og invasjon av kreftceller. Mekanikkindusert YAP-translokasjon fra cytoplasma til kjernen aktiverer transkripsjon av gener relatert til cellemigrasjon, spredning, invasjon og apoptose, noe som fører til avvikende celleatferd28,29,30,31. Dette arbeidet hadde som mål å utforske den potensielle korrelasjonen mellom YAP N/ C-forholdet og cellemekanikken i to typiske humane lungekreft og normale cellelinjer. I løpet av 10 h cellespredningsperioden viser PC9-celler lignende YAP-konsentrasjoner i kjernen og cytoplasma (figur 3D og figur 5A). B2B-celler viser en høyere YAP-konsentrasjon i kjernen enn i cytoplasma (figur 3C og figur 5A). Dette forholdet som ble funnet i det tidlige spredningsstadiet er forskjellig fra de fleste publiserte funn som sammenligner YAP-konsentrasjon i kjernen mellom normale og kreftceller. Selv om de ikke nødvendigvis er i det tidlige spredningsstadiet, viser de fleste publiserte funn at YAP er mer konsentrert i kjernen av kreftceller enn i kjernen av normale celler27,28. Bare en studie om brystkreft rapporterte et unntak32 som viser at YAP er mer konsentrert i cytoplasma, som er enig med våre nåværende observasjoner gjort i lungekreft PC9-celler. Så vidt forfatterne vet, er dette arbeidet det første som viser et lavere YAP N / C-forhold i en menneskelig lungekreftcellelinje. Forfatterne hypoteser at årsaken til et stabilt YAP N / C-forhold i PC9-celler kan skyldes den lave variasjonen i celle / kjernespredningsområdet og trekkraft i PC9-celler i det tidlige spredningsstadiet. Disseksjonen av de understøttende molekylære mekanismene for lavt YAP N/C-forhold i PC9- og B2B-celler pågår.
I løpet av de første 10 h med spredning viser disse to cellelinjene en tydelig sammenheng mellom YAP I/C-forholdet, cellegrep og oppslagsområde (figur 5). For B2B-celler er et høyere YAP N/C-forhold korrelert med et høyere celle- og kjerneoppslagsområde (figur 6A,B), som samsvarer med de rapporterte dataene i andre normale celler33. Interessant, selv om den utviklingsmessige trenden i dette forholdet generelt finnes i alle B2B-celler som er registrert, finnes to forskjellige grader (høye og lave) av dette forholdet. B2B-celler som sprer seg og migrerer samtidig, viser lavere trekkraft og høyere celle- og kjernespredningsområde med høyere YAP N/C-forhold (2,05 ± 0,32). For B2B-celler som sprer seg og forblir på samme sted, viser de høyere trekkraft og nedre celle- og kjernespredningsområde med et lavere YAP N /C-forhold (1,74 ± 0,21). Disse to relasjonsgradene er demonstrert i de todelte spredte datagruppene (figur 6C, D). Som rapportert i litteraturen har stasjonære normale celler, som embryonale fibroblast NIH 3T3-celler, høyere trekkraft enn trekkceller34. Dataene som rapporteres i dette dokumentet antyder at sprednings- og ikke-migrerende B2B-celler brukte høyere trekkraft enn å spre og migrere B2B-celler, noe som sannsynligvis tyder på at høy trekkraft er nødvendig for ikke-migrerende celler for å stabilisere seg på substratet.
I tillegg viser disse dataene at stasjonære normale B2B-celler genererer en høyere peri-kjernefysisk kraft, mens tidligere forskning utført av andre forskere rapporterte bare høyere celle trekkraft generert i periferien av stasjonære celler34,35,36,37. Forfatterne tror at forskjellen i den iboende tendensen til migrasjon i forsøkene kan føre til disse motstridende resultatene. I de publiserte eksperimentene hadde firkantet mikropatterning blitt brukt til å begrense enkeltceller fra å spre og hemme migrasjon; om cellene hadde en tendens til å migrere er ukjent. Ettersom trekkceller ofte viser høy trekkraft i periferien av cellene38, er det sannsynlig at celler med tendens til å migrere fortsatt vil opprettholde høy periferi trekkraft selv om overføringen er begrenset. I denne nåværende studien er de stasjonære cellene ikke begrenset av noen mikropattern, men migrerer ikke, noe som indikerer at cellene har en tendens til å opprettholde sin ikke-migrerende tilstand. En annen mulighet er at celleformen definert av mikropatternen kan påvirke fordelingen av fokale vedheft og trekkraftkrefter39. Resultatene i denne studien ble generert uten begrenset mikropatterning og representerer kraftfordelingen av stasjonære celler i sin opprinnelige form.
Så vidt forfatterne vet, rapporterte bare en publikasjon til dags dato spesifikt funn av peri-nukleære krefter i normale celler (mus embryonale fibroblaster), potensielt forårsaket av aktin cap som spenner over kjernen40. YAP cytoplasma-til-kjernetranslokasjon er korrelert med økningen i peri-kjernefysisk kraft40. Et grundig søk i den aktuelle litteraturen ga ingen publikasjonersom rapporterte en peri-kjernefysisk kraft eller aktin cap i kreftceller. En indirekte studie på melanomkreftceller viste at aktinkanten (en annen peri-nukleær actin-organisasjon som ligger rundt, men ikke dekker kjernen) reduserer cellemigrasjonsratene41, noe som indirekte antyder eksistensen av en peri-kjernefysisk kraft. Det rapporteres imidlertid ingen direkte eksperimentelle data. I denne studien fant forfatterne at både PC9- og B2B-celler viser peri-kjernefysisk forskyvning og trekkraft. Mekanismene for genereringen av peri-nukleære krefter og deres effekter forblir kontroversielle. I normale celler ble aktinhetten rapportert å spille en rolle i å regulere kjernens morfologi og kromatinorganisasjon42, overføre mekaniske signaler fra fokale adhesjoner inn i kjernen gjennom koblinger av nukleoskeleton og cytoskjelett (LINC) complex43, og regulere cellemigrasjon44. Lamin A/C er relatert til dannelsen og forstyrrelsen av aktin cap40,41,42,43,44. Rapporten som hevdet at aktin-hetten genererer en peri-kjernefysisk kraft, vurderte imidlertid ikke actin rim40s potensielle rolle. I kreftceller letter overekspressering av Lamin A dannelsen av en aktinkant og begrenser kreftcellemigrasjon. Overekspression av Lamin B reduserer aktin felgdannelse og fremmer migrasjon. Den peri-kjernefysiske styrken kan være involvert i denne prosessen på grunn av eksistensen av peri-kjernefysisk actin organisasjon og effekten av Lamin A. Resultatene av denne studien viste imidlertid ingen bevis for målte peri-nukleære krefter eller oppførselen til aktin-hetten. Derfor er oppdagelsen av peri-nukleære krefter i PC9-celler i denne nåværende studien den første rapporten som viser peri-nukleære krefter og forskyvninger i lungekreftceller. Forfatterne undersøker for tiden molekylære mekanismer og funksjoner til peri-nukleære krefter i CRISPR / Cas9-konstruerte PC9- og B2B-celler.
Utover det helt optiske mekanobiologiforhøret som er demonstrert i dette papiret, kan det integrerte multifunksjonelle systemet brukes til optisk å sondere et utall andre essensielle fysiologiske og patologiske signaler i levende systemer. Eksempel: forfatternes laboratorium har nylig etablert flere stabilt transduserte cellelinjer for human kreft som samtidig uttrykker tre lysresponsive membranproteiner: membranspenningsindikator QuasAr2 (eksitasjon: 640 nm; utslipp: 660 nm-740 nm), membranspenningsdepolarizer CheRiff (eksitasjon: 488 nm) og membranspenning hyperpolarizer eNpHR3 (eksitasjon: 590 nm). Disse tre funksjonelle proteinene kan aktiveres av spektrum-ortogonale laserlinjer på en krysstalefri måte, noe som muliggjør alloptisk toveis signalkommunikasjon (avlesning og kontroll) av membranelektrofysiologi. Ved hjelp av et integrert opto-elektronikksystem og en manuell patch-clamp har forfatterne validert den helt optiske kontrollen og avlesningen av membranspenningen (Vm) i enkeltmenneskelige kreftceller og multicellulære tumorsfæroider. Det alloptiske elektrofysiologiavhøret åpner muligheten for detaljerte undersøkelser av tidligere utilgjengelig bioelektrisitet i kreftceller, noe som kan bidra til å fremme tumorbiologi fra en ny akse.
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet støttes økonomisk av Cancer Pilot Award fra UF Health Cancer Center (X. T. og D. S.) og Gatorade Award Start-up Package (X. T.). Forfatterne setter oppriktig pris på de intellektuelle diskusjonene med og de tekniske støttene fra Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Ji-Hyun Lee (Biostatistics, UF), Dr. Hugh Fan (MAE, UF), Dr. Warren Dixon (MAE, UF), Dr. Ghatu Subhash (MAE, UF), Dr. Sheplak (MAE &ECE, UF), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE, UF), Dr. UF), Dr. Matthew Traum (MAE, UF), Dr. David Hahn (University of Arizona), Dr. Weihong Wang (Oracle Corporation), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University) og supportteamet til Nikon (Dr. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon og Jon Ekman). Forfatterne er dypt takknemlige for den sjenerøse og effektive støtten fra alle medlemmer av Tangs, Siemanns og Leans forskningslaboratorier og alle ansatte i MAE &ECE &Physics &Radiation Oncology Departments, UF.
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-aldrich | 440140 | |
0.05 % Trypsin | Corning | 25-051-CI | |
75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
8 Benchtop Centrifuge | Thermo | 75007210 | |
A1R confocal system | Nikon | HD25 | |
Acetic acid | Sigma-aldrich | 695092 | glacial, ACS reagent, ≥99.7% |
BEAS-2B (B2B) cells | Sigma-aldrich | 95102433 | human epithelial cells from lung tissue |
Carboxylate-Modified Microspheres | Invitrogen | F8797 | |
Culture medium (RPMI-1640) | Gibco | 11875093 | |
Desktop Computer | Dell | 2018 | with Windows 10 operating system |
Environmental chamber TIZB | Tokai Hit | TIZB | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140 | |
Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
Fiji ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | 1.53k | |
Glass-bottom petri dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
HEPES buffered saline | Sigma-aldrich | 51558 | |
Hydrazine hydrate solution | Sigma-aldrich | 53847 | |
IntelliJ IDEA | JetBrains | 2020 | Java development platform |
Java Development Kit | Oracle | 14.0 | |
Kimwipe | Kimtech Science | 3066-05 | |
MATLAB | MathWorks | 2020b | |
Monochrome Camera | FLIR | BFS-U3-70S7M-C | |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-218 | |
N,N′-Methylenebisacrylamide solution | Sigma-aldrich | M1533 | |
NIS-Elements software platform | Nikon | 4.50 | software platform |
Origin | OriginLab | OriginPro 2017 (Learning Edition) | data analysis and graphing software |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
PC9 cells | Sigma-aldrich | 90071810 | human adenocarcinoma cells from lung tissue |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-553S | high-fidelity DNA polymerase |
Scotch tape | Scotch | adhesive tape | |
Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma-aldrich | 05030 | |
Super glue | Gorilla | cyanoacrylate glue | |
Ti2-E inverted microscope | Nikon | MEA54000 | |
TI2-S-SE-E Motorized Stage with Encoder | Nikon | MEC56120 | |
μManager | version 2.0 gamma | open source microscopy software (https://micro-manager.org/) |