Helt optisk mekanobiologi Förhör av ja-associerat protein i mänskliga cancer och normala celler med hjälp av ett multifunktionellt system

Summary

Detta dokument presenterar ett detaljerat stegvis protokoll om hur man använder ett integrerat multifunktionellt och användarprogrammerbart system som möjliggör automatisk multikanalig avbildning och mekanobiologisk analys för att klargöra mekanokänsligheten hos Yes-associerat protein (YAP).

Abstract

Långsiktig multifunktionell avbildning och analys av levande celler kräver strömlinjeformad, funktionell samordning av olika hårdvaru- och mjukvaruplattformar. Manuell kontroll av olika utrustningar som produceras av olika tillverkare är dock arbetsintensiv och tidskrävande, vilket potentiellt minskar noggrannheten, reproducerbarheten och kvaliteten på förvärvade data. Därför kan ett allt-i-ett- och användarprogrammerbart system som möjliggör automatiskt, multifunktionellt och långsiktigt bildförvärv och är kompatibelt med de flesta fluorescerande mikroskopiplattformar gynna forskarsamhället. Detta dokument introducerar de kompletta driftsprotokollen för att använda ett nytt integrerat mjukvarusystem som består av (1) ett hembyggt program, med titeln “Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP),” som möjliggör automatisk multikanals bildförvärv, och (2) en serie kvantitativa bildanalys- och celltraktionsberäkningspaket.

Detta integrerade system tillämpas för att avslöja det tidigare okända förhållandet mellan spatial-temporal fördelning av mekano-känsliga Yes-associerade protein (YAP) och cellmekaniken, inklusive cellspridning och dragkraft, i CRISPR/ Cas9-konstruerade mänskliga normala celler (B2B) och lungcancerceller (PC9). Genom att utnyttja systemets förmåga till flerkanalig kontroll och avläsning visar resultatet: (1) B2B normala celler och PC9-cancerceller visar ett distinkt samband mellan YAP-uttryck, dragkraft och celldynamik under cellspridnings- och migreringsprocesser; och (2) PC9-cancerceller applicerar märkbara peri-nukleära krafter på substrat. Sammanfattningsvis presenterar detta dokument ett detaljerat stegvis protokoll om hur man använder ett integrerat användarprogrammerbart system som möjliggör automatisk multifunktionell avbildning och analys för att klargöra YAP-mekanokänslighet. Dessa verktyg öppnar möjligheten för detaljerade utforskningar av mångfacetterad signaldynamik i samband med cellfysiologi och patologi.

Introduction

Det övergripande målet med denna metod är att möjliggöra alloptisk multifunktionell avbildning och analys av levande celler. Ett allt-i-ett-bildprogram som möjliggör automatisk samordning av multifunktionella optoelektroniska enheter kommer att minska arbetsintensiva och felbenägna manuella operationer och är avgörande för att forskare ska kunna utföra långsiktig live-cell imaging1,2,3,4. De flesta befintliga offentliga program inom den biomedicinska forskarvärlden gäller dock antingen endast begränsade optoelektroniska enheter eller kräver ytterligare hårdvara för samordning av olika utrustningar5,6,7,8,9. Nyligen har ett program med öppen källkod och programvara utvecklats med titeln “Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP),” som möjliggör multikanals- och timelapse-avbildning. Baserat på Java-språk och API (Application Programming Interface) av ^{μManager11,12}, utvecklades AMFIP som ett plugin i μManager som kör anpassade Java-skript för att utföra programvarubaserad kommunikation av flera optoelektroniska hårdvaru- och programvaruplattformar, inklusive men inte begränsat till dem från Nikon. Inrättandet av AMFIP öppnar möjligheten för programmerbara och multifunktionella förhör av cellbeteenden. Ett integrerat experimentellt och beräkningssystem utvecklas i detta dokument och kombinerar AMFIP med digital avbildningsanalys och celldragkraftmikroskopi. Systemet möjliggör klargörande av den distinkta YAP-mekanobiologin i CRISPR/Cas9-konstruerade mänskliga normala B2B (figur 1) och lungcancer PC9 (figur 2) cellinjer. Systemet ger forskarsamhället en omfattande lösning som undviker efterfrågan på att köpa ytterligare styrenheter som kanske inte är tillgängliga för och/eller kompatibla med alla bildsystem.

Protokollen som presenteras i detta dokument introducerar hur man (1) tillämpar AMFIP för att utföra automatisk långsiktig avbildning för både CRISPR/ Cas9-konstruerade cellinjer som uttrycker mNEonGreen2-taggad YAP; och (2) kombinera Fiji ImageJ, MATLAB och Origin för kvantitativ analys av YAP-förhållandet mellan kärn-/cytoplasma (N/C) baserat på deras fluorescerande intensitet (figur 3 och figur 4), cellulärt deplacementfält (figur 1C och figur 2C) och cellulärt dragkraftsfält (figur 1D och figur 2D ). Resultaten tyder på att (1) under de första 10 h cellspridningen på substrat som har fysiologiskt relevant mekanisk styvhet13,14,15,16,17,18, YAP N/C-förhållandet för enstaka B2B-celler visar mer märkbar tidsberoende variation och fluktuation jämfört med enstaka PC9-celler (figur 5 och figur 6 ); och 2) PC9-cancerceller genererar märkbar dragkraft i sina peri-nukleära regioner (figur 7). Det integrerade system och metoder som beskrivs i detta protokoll överskrider de specifika typerna av celler och optogenetiska molekyler. Forskare kan tillämpa protokollen för att anpassa sina specifika förhörsexperiment i levande celler och belysa mångfacetterad signaldynamik i samband med cellfysiologi och patologi.

Protocol

1. Generering av stabil CRISPR/Cas9-redigerad mänsklig lungcancer cellinje (PC9) och human bronkial epitelcelllinje (Beas2B) som endogent uttrycker mNeonGreen21-10/11-märkt YAP-protein Utför polymeraskedjereaktion (PCR) för att förstärka DNA-sekvensen som kodar den elfte delen av fluorescensproteinet, mNeonGreen2, med hjälp av DNA-polymeraset med hög återgivning (se materialtabellen). Knock-in den förstärkta DNA-sekvensen i YAP genomiska locus av PC9 och B2B cellinjer med hjälp av CRISPR-Cas9 genredigeringssystem.OBS: Denna DNA-sekvens kompletterar strängarna 1-10 mNeonGreen2 för att avge fluorescens. Den genomiska sekvenskartan för YAP-mNeonGreen21-10/11 visas i kompletterande figur S1. Kartan innehåller de märkta genomiska, donator- och mNeonGreen2-sekvenserna. Kontrollera CRISPR/Cas9-konstruerade mNeonGreen2-uttrycket med hjälp av ett epifluorescensmikroskop (se materialtabellen). Eftersom mNeonGreen2 är taggad till YAP när cellerna uttrycker YAP i samband med sitt inhemska genregleringsnätverk, kontrollera förekomsten av fluorescensintensiteten i både CRISPR / Cas9-konstruerade celler och jämför den med den i föräldracellerna (kontroll).OBS: För att följa detta protokoll, använd (1) en 488 nm laser (47,5 mW/mm2) för excitation, (2) ett 40x-mål (numerisk bländare (NA) = 0,95) och ett band-pass-emissionsfilter (ET525/50 nm) för fluorescensmätning och (3) ImageJ-programvara för att mäta, kvantifiera och jämföra fluorescensintensiteterna. Bekräfta korrekt integrering av mNeonGreen211 genom att extrahera genomiskt DNA från CRISPR/Cas9-redigerade cellinjer; utföra PCR med hjälp av primers flankerar genomisk insats och sekvensering för att bekräfta införandet vid rätt genomisk loci19,20. Slå ner mNeonGreen211 med hjälp av genredigeringssystemet CRISPR/Cas9 och kontrollera fluorescensintensitetens minskning av celler med samma mikroskopsystem och bildparametrar som beskrivs i steg 1.3.OBS: Detta steg bekräftar korrekt integration av mNeonGreen211 genom jämförelse av fluorescensintensiteter. Crispr/Cas9-konstruerade celler utan knock-down och föräldraceller används som kontroll. Samla cellerna med det taggade proteinet av intresse genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) sortering. För att förbereda celler för FACS-sortering, prova dem och återanvända dem i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Samla celler med mNeonGreen2 fluorescens över bakgrundsnivån för föräldracelllinjerna i två berikande omgångar av FACS-sortering.Tidslinjen för att generera de CRISPR/Cas9-redigerade cellinjerna som beskrivs här är i 1-2 månaders ordning. Alla cellinjer görs tillgängliga för allmänheten på begäran så att andra forskningslaboratorier kan reproducera resultaten. 2. Underhåll av PC9- och B2B-celler Håll båda cellinjerna i fuktade vävnadsodlingskuvöser med 5% CO2 vid 37 °C. Kultur 106 endogent märkta PC9- och Beas2B-celler i 75 cm2 flaskor med 12 ml RPMI-1640 medium kompletterat med 10% fetalt bovinserum och 100 μg/ml penicillin-streptomycin. Subkultur båda cellinjerna när cellkonfluensen når ~80%. Testa båda cellinjerna för mykoplasma var tredje månad med hjälp av ett mykoplasmadetekteringskit, enligt alla tillverkarens rekommenderade protokoll strikt. Förvara cellinjerna i en frys på -80 °C. Använd de cellinjer som är <20 passager från upptining för alla experiment. 3. Installation av maskinvaru- och programvarumiljö Installation av maskinvarumiljö för experimentet Anslut den konfokala styrenheten och det inverterade mikroskopet till datorn (se materialförteckningen). Installera programvaruplattformen (Table of Materials). Slå på den konfokala styrenheten och det inverterade mikroskopet. Starta sedan Elements. Öppna kontrollpanelerna för konfokal, laser och det inverterade mikroskopet i Elements. Kontrollera sedan om de tre panelerna fungerar korrekt genom att testa det motoriserade stadiets rörelse, omkopplingen av mikroskopmålen och den rumsliga skanningen av laserlinjerna. Installation av programvarumiljö för AMFIP Installera IntelliJ, Java Development Kit 14.0, μManager version 2.0 gamma och Fiji ImageJ på datorn. Öppna AMFIP-projektet som hämtats från GitHub (länk: https://github.com/njheadshotz/AMFIP) i IntelliJ. Klicka på Inställningar | Kompilator | Anteckningsbehandlare och markera Aktivera anteckningsbearbetning. Klicka på Projektstruktur | Artefakter och skapa en JAR-fil. Ställ in utdatakatalogen på mmplugins under katalogen μManager . Klicka på Projektstruktur | Bibliotek och lägg till mmplugins och plugins under μManager-katalogen . Klicka på lägg till Konfiguration under den nedrullningsbar menyn Kör och skapa ett program. Ange ij. ImageJ in i huvudklassen. Ange alternativet -Xmx3000m -Dforce.annotation.index=true i vm. Ange katalogen μManager på arbetskatalogen. Klicka på Kör för att aktivera μManager med AMFIP-plugin. Anslut μManager med det inverterade mikroskopet. Lägg till den adaptiva drivrutinen för det inverterade mikroskopet21 i μManager-katalogen . Öppna μManager. Klicka på Enheter | Guiden Maskinvarukonfiguration och skapa en ny konfiguration. Lägg till Ti2-drivrutinen under Tillgängliga enheter. Markera alla kringutrustningar och spara den nya konfigurationsfilen. Starta om μManager och välj konfigurationsfilen i steg 3.2.4 i Micro-Manager Startup Configuration. 4. Gelberedning Behandla glasöverdraget med 3-aminopropyltrymethoxysilane i 7 min vid rumstemperatur (24 °C). Använd avjoniserat (DI) vatten för att skölja glasöverdraget och torka täcket i 20 min vid 160 °C. Behandla glasöverdraget med 0,5% glutaraldehyd i 30 minuter och skölj med DI-vatten. Blanda akrylamidlösning, N,N′-metylenebisakrylamidlösning (bis) och fluorescerande pärlor upphängda i 10 mM HEPES-buffrad saltlösning. Använd 10% (w/v) ammoniumpersulfatlösning och N,N,N′, N′-tetrametylletylendiamin (TEMED) som initiativtagare till polymerisation. Ändra procentandelen av varje komponent för att uppnå önskad mekanisk styvhet hos polyakrylamid (PAA) hydrogeler enligt etablerade protokoll som beskrivits tidigare13,14.OBS: I detta protokoll, 2 kPa gel: akrylamid = 12,5% och bis-akrylamid = 6,5%; 5 kPa gel: akrylamid = 12,5% och bis-akrylamid = 21,5%; och 40 kPa gel: akrylamid = 12,5% och bis-akrylamid = 31,5%. Alla % som anges är volymprocent. Efter 35 minuter skalar du glasskyddet från den stelnade PAA-hydrogelen och tvättar hydrogelen med 50 mM HEPES-buffrad saltlösning två gånger (5 min varje gång). Behandla hydrogelytan med en hydrazinhydratlösning i 6 timmar. Skölj hydrogelen med ättiksyra i 30 minuter. Ta bort ättiksyran och skölj med PBS i 30 minuter. Oxidera fibronectinlösningen (50 μg/ml i PBS) med natrium periodat i 30 min. Täck hydrogelytan med den oxiderade fibronectinlösningen och vänta i 35 min. Tillsätt PBS för att sänka ner hydrogelen och förvara vid 4 °C. Täck alla Petri-rätter som innehåller hydrogelerna med aluminiumfolie för att undvika ljusexponering för hydrogelerna. 5. Cellkultur OBS: Utför cellkultur med aseptisk teknik. Bind ihop glasöverdragen med PAA-hydrogelerna till petriskålen med 35 mm glasbotten för att undvika fysisk drift av geler under cellsådds- och avbildningsprocesserna. Lyft täcket (med PAA-hydrogelen ovanpå) från Petri-skålen som innehåller de beredda gelerna med steriliserade rena pincett. Använd en torrservett för att rengöra vattendroppar på glasöverdragets bottenyta. Använd de steriliserade pincetterna för att hålla i glasskyddet. Placera små droppar (1-5 μL) cyanoakrylatlim vid de två diagonala hörnen på bottenytan. Använd steriliserade våtservetter för att avlägsna överflödigt lim. Använd de steriliserade pincetterna för att byta ut täcket i petriskålen med glasbotten. Tryck något på hörnen på täckslipet för att säkerställa att limdropparna kommer i full kontakt med petriskålens yta. Sätt tillbaka locket på Petri-skålen för att minimera avdunstningen av PBS i PAA-hydrogelerna. Vänta i 3 min så att limet stelnar och torkar i Petri-skålen. Fyll Petri-skålen med 4 ml PBS. Upprepa ovanstående steg 5.1.1-5.1.8 för de återstående PAA-hydrogelproverna i Petri-disken som används för avbildning. Använd 75% etanol för att sterilisera den yttre ytan av alla Petri-rätter och överföra dem till vävnadskulturens biosäkerhetsskåp. Slå på ultraviolett ljus i 5 minuter och sterilisera proverna. Frö cellerna på gelens övre yta. Stäng av ultraviolett ljus. Ta ut kolven (som innehåller B2B/PC9-celler) från inkubatorn 37 °C till biosäkerhetsskåpet. Använd en pipett ansluten till en vakuumpump för att aspirera hela odlingsmediet och tillsätt 5 ml PBS för att tvätta kolven. Tillsätt 2 ml 0,05 % trypsin för att lossa cellerna från botten av kolven. Placera kolven i inkubatorn. Vänta i 5 min. Överför kolven till biosäkerhetsskåpet. Tillsätt 8 ml färskt odlingsmedium till kolven och pipetten upp och ner flera gånger för att suspendera cellerna homogent. Överför alla 10 ml cellfjädring till ett 15 ml rör och centrifug vid 300 × g i 5 min. Kontrollera cellpelleten längst ner i röret. Luta röret långsamt horisontellt och använd aspirerande pipetten för att ta bort allt odlingsmedium från röret utan att röra cellpelleten. Tillsätt sedan 8 ml färskt odlingsmedium och pipett upp och ner flera gånger tills alla celler blandas homogent med mediet. Sätt 100 μL av cellupphängningen (150 celler/μL) på gelytan och vänta i 5 minuter. Lägg sedan långsamt till 4 ml färskt odlingsmedium till Petri-rätterna; undvik att tillsätta det färska mediet direkt på gelén. Placera Petriskålen i inkubatorn 37 °C. Vänta med att låta cellerna fästa på gelytan (B2B: 0,5-1 h; PC9: 4-5 h). 6. Cellavbildning OBS: AMFIP möjliggör automatisk, flerkanalig och långsiktig avbildning genom att samordna med olika hårdvaru- och programvarusystem: (1) AMFIP manipulerar μManager för att automatiskt flytta det motoriserade stadiet av Ti2-E-mikroskopet till flera synfält (FOVs) och förvärva ljusfältsbilder genom en monokrom kamera (Materialförteckning); och (2) AMFIP aktiverar flera makrofiler inuti elements med ett anpassat Java-skript för att utföra automatiska åtgärder för konfokal z-stackavbildning och växling av olika laserkanaler (405 nm och 488 nm). Ställ in miljön för långsiktig avbildning. Placera miljökammaren på det motoriserade stadiet av det inverterade mikroskopet. Ställ in CO2-flödet på 160 ml/min och justera kammarens temperatur (topp: 44 °C; bad: 42 °C; steg: 40 °C). Tillsätt sedan 40 ml renat vatten i kammarens bad. Ta ut petriskålen med glasbotten med celler från inkubatorn och placera den i miljökammaren. Slå på den konfokala styrenheten och det inverterade mikroskopet. Byt ljusväg åt höger och observera cellerna som fästs med μManager. Om tillräckligt med celler har fästs på gelén, överför Petri-skålen tillbaka till inkubatorn. Om inte tillräckligt med celler har fästs vid gelén, fortsätt cellinkubationen i ytterligare 30 min för B2B och 60 min för PC9-celler. Skär två små bitar tejp och sätt dem på kammaren runt det cirkulära hålet. Applicera sedan lite självhäftande lim på tejpen (endast på det område som Petri-skålen kommer att täcka). Ta ut Petri-skålen från inkubatorn. Placera sedan långsamt Petri-skålen i kammaren och låt botten av skålen komma i kontakt med limet. Tryck på locket på Petri-skålen i 1 min så att limet kan komma i full kontakt med Petri-skålen och stelna. Tryck sedan försiktigt Petri-skålen horisontellt för att bekräfta att Petri-skålen är otagbar i kammaren. Stäng kammarens lock. Ange parametrar för bildförvärv för ljusfältsavbildning. Öppna IntelliJ och ange en parameter T1 (t.ex. 120 s) i rad 93 i filen Elements_script.java. Kontrollera att det här värdet är större än makrots körtid i Element som används för konfokal avbildning av ett synfält (FOV). Klicka på knappen Kör för att starta AMFIP IntelliJ-projektet. Klicka på knappen Live och Multi-D Acq. Växla sedan ljusvägen för det inverterade mikroskopet till höger för ljusfältsavbildning, byt till 10x-målet och öppna lysdiodlampan (LED) (ljuskällan för ljusfältsavbildning; intensitet: 5%). Klicka på ljusbanan, mikroskopmålet och LED-lampknappen i Elements Ti2-panelen eller tryck manuellt på motsvarande knappar på mikroskopet. Justera XY joysticken och ratten på Z-planet för att hitta rätt position och geléns fokusplan på Petri-skålen. Använd ett 10x-mål för att hitta lämpliga FOV av flera enskilda celler som är fästa vid gelén. Markera rutan Flera positioner (XY) i fönstret Flerdimensionellt förvärv . Klicka på knappen Redigera position lista… och observera fönstret Scenpositionslista som dyker upp. Ändra sedan målet till 40x, öka LED-lampans intensitet till 15%, justera om det XY-motoriserade steget för att hitta FOV: erna och spela in koordinaterna genom att klicka på markeringsknappen i fönstret Scenpositionslista . Spela in 67 önskade FOV: er. Klicka på knappen Spara som… i fönstret Scenpositionslista för att registrera koordinaterna. Ingång T1 (parametern, t.ex. 120 s, definierad i steg 6.2.1) i tidsintervallet för bildförvärv till T1 i avsnittet Tidpunkter i fönstret Flerdimensionellt förvärv . Ställ in bildförvärvet för 2D-YAP- och pärlbilder. Öppna element, ändra ljusvägen till höger för konfokal avbildning och stäng av LED-lampan. Klicka sedan på knappen Ta bort förregling och slå på FITC-laserkanalen (för YAP-avbildning) genom att markera FITC-rutan . Justera skanningshastigheten till 1 bildruta per 2 s genom att klicka på 1/2-knappen och snurra Z-planets ratt för att snabbt hitta Z-positionen för de bifogade cellerna. Registrera de nedre och övre gränserna för Z-stacken. Klicka på Makro i menyfliksområdet, välj Makroredigeraren under den nedrullningsbara makromenyn och mata in värdena från steg 6.3.2 i en makrofil. Slå på laserkanalen 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) (för pärlavbildning) genom att kontrollera DAPI-rutan för att hitta och registrera pärlornas fokuserade Z-position. Gå till Makroredigeraren och mata in de inspelade värdena i makrofilen. Ställ in uppgiften att flytta det motoriserade steget med AMFIP. Gå till μManager och klicka på Plugins | Automatisering för att öppna det grafiska användargränssnittet (GUI) för AMFIP. Klicka på knapparna Lägg till punkt eller Ta bort punkt för att hämta det exakta antalet fovs som valts. Mata in fovs inspelade koordinater i koordinatpanelen. Definiera den totala experimenttiden i textfältet Total experimenttid . Klicka på knappen Ytterligare tidskonfiguration och definiera tidsintervallet T2 (t.ex. 30 min) för att flytta det motoriserade steget till varje FOV. Maximera fönsterstorleken på Element och dra AMFIP:s grafiska gränssnitt till höger på skärmen för att undvika att gui-gränssnittet stör markörens automatiska åtgärder. Klicka på knappen Retur . När det första makrot är klart klickar du på knappen Hämta! i fönstret Flerdimensionellt förvärv . Lös upp cellerna efter bildförvärvet. När du har avslutat den långsiktiga avbildningen stoppar du AMFIP-uppgiften genom att klicka på pausknappen i fönstret för automatiseringsplugin och stoppknappen i fönstret Flerdimensionellt förvärv . Öppna element och ställ in Z-stack-avbildning genom att klicka på knapparna Över- och nederkant i ND-förvärvsfönstret (ställ in Z-intervallet så att det är större än pärlornas Z-intervall). Byt ljusväg åt höger och öppna LED-lampan (intensitet: 15 %). Ta långsamt och försiktigt bort locken i kammaren och Petri-skålen. Under tiden övervakar du ljusfältsvyn för någon drift av FOV. Använd en plastpipett för att ta upp 0,5 ml natriumdodecylsulfatlösning (SDS) lösning, håll försiktigt plastpipetten lite ovanför odlingsmediet i Petri-skålen och tillsätt 1-2 droppar av SDS-lösningen i odlingsmediet. När cellerna i ljusfältsvyn har lösts upp växlar du ljusbanan åt vänster, stänger LED-lampan och klickar på knappen Ta bort förregling . Kör Z-stack imaging. Spara bildstacken och namnge den som Reference_N (N är sekvensnumret för varje FOV). Klicka på knappen Flera positioner (XY) i fönstret Flerdimensionellt förvärv . Välj sedan nästa FOV och klicka på knappen Gå till för att flytta det motoriserade steget till den andra FOV. Upprepa steg 6.5.7 för varje FOV. 7. Mätning av YAP N/C-förhållandet Utför bildanalys för att mäta YAP N/C-förhållandet med hjälp av Fiji ImageJ-programvaran (bild 4). Öppna Fiji ImageJ. Importera ljusfältsbildstacken för alla FOV som förvärvats av μManager. Öppna rullgardinsmenyn Bild och välj Staplar | Verktyg | Skiva väktaren. Exportera sedan bildstapeln för ljusfält för varje FOV. Importera fluorescensbilden av FITC-kanalen och överlagra den med ljusfältsbilden för samma FOV. Det gör du genom att välja den fluorescerande bilden och välj Överlägg | Lägg till bild… (Bild att lägga till: ljusfältsbilden; X- och Y-platsen beror på storleken på den ljusa fältbilden som förvärvats av olika kameror. Opacitet: 60-70). Öppna listrutan Analysera och välj Ange mått…. Välj område; Integrerad densitet och Medelvärde grå värde. Klicka på freehand-urvalsknappen på huvudgränssnittet för ImageJ. Rita konturen av cellkroppen och den önskade kärnan. Klicka sedan på Analysera | Mät eller tryck på M-knappen på tangentbordet. Observera fönstret Resultat som dyker upp. Observera att värdena under kolumnen Område representerar området i det valda området (μm2) och värdena under kolumnen IntDen representerar fluorescensintensiteten i det valda området. Beräkna YAP N/C-förhållandet med följande formler (1), (2) och (3): (1) (2) (3)Där Inuc och Icel representerar den relativa intensiteten i kärnan och cellkroppen, och Anuc och Acel representerar kärnans och cellkroppens område. R är YAP N/C-förhållandet. Spara konturerna för framtida beräkning av dipolkraftkraft och pericell/peri-nukleär förskjutning. För att göra detta, klicka på Analysera | Verktyg | Spara XY-koordinater… 8. Mätning av dragkraftsfält Applicera traction force mikroskopi genom Fiji ImageJ plugins22,23. Öppna Fiji ImageJ. Importera bildstapeln med pärlor för en FOV. Välj det segment som visar den tydligaste fördelningen av pärlor och extrahera det genom att klicka på Bilder | Staplar | Verktyg | Skiva väktaren. Importera bildstapeln för referensen för samma FOV. Välj segmentet med samma ljusstyrka och kontrast som segmentet i steg 8.1.3. Extrahera den sedan som en referensbild. Välj bilder | Staplar | Verktyg | Sammanfoga om du vill kombinera de två segmenten från steg 8.1.3 och 8.1.5 (välj referensbilden som det första segmentet). Välj plugins | | för mallmatchning Justera segment i stack eller plugins | Bildstabilisator för att justera de två segmenten. Välj Bild | Staplar | Stapla till bilder. Välj sedan Bild | Uppslagstabeller | Grönt om du vill konvertera färgen på det första segmentet till grönt och välja Bild | Uppslagstabeller | Röd om du vill konvertera färgen på den andra segmentet till röd. Välj Bild | Färg | Sammanfoga kanaler för att sammanfoga de två bilderna. Överlappa bilden med ljusfältsbilden från samma FOV och använd den här överlappande bilden för att observera pärlförskjutningen. Välj plugins | PIV | iterativ PIV(Basic)…. Ställ in förhörsfönstrets storlek på 128/256; 64/128; 32/64 (minst fyra pärlor per förhörsfönster). Ställ in korrelationströskeln till 0,6. Klicka på OK. När beräkningen är klar sparar du textfilen med rådata för pärlförskjutning i en vanlig mapp som skapats av användaren. Välj plugins | FTTC | FTTC och välj textfilen i steg 8.1.9. Mata in pixelstorleken (μm), Youngs modulus av gelén (Pascal) och tomtens bredd och höjd baserat på experimentet och bilden av pärlor. Klicka på OK för att automatiskt spara textfilen som innehåller rådata för dragkraft i samma katalog som textfilen i steg 8.1.12. Använd grafprogramvara (Tabell över material) för att rita dragkraftsfältet med samma skala för flera celler (figur 1B, C och figur 2B,C). Infoga textfilen som innehåller rådata för dragkraft i ett kalkylblad. Skapa ett nytt blad, mata in Y-koordinaterna för dragkraft i den första raden (ordna från höga värden till låga värden) och X-koordinaterna i den första kolumnen (ordna från låg till hög). Mata in värdet av dragkraft till varje koordinat från rådata. Spara bladet i steg 8.2.2 som en *.csv fil. Öppet ursprung. Klicka på Arkiv | Öppna och importera filen *.csv i steg 8.2.4. Markera alla celler och klicka på Rita | Kontur| Kontur – Färgfyllning. I plotting: plotvm-fönstret väljer du Y över kolumnerna för att automatiskt ange Y-värdena till den första raden och X-värdena till den första kolumnen. Namnge sedan titeln och klicka på OK. Dubbelklicka på värmekartan i diagramfönstret som dyker upp. Klicka på Nivåer i fönstret Colormap/Contours . Ändra sedan skalnivån till ett rimligt intervall (0300 i den här analysen) och klicka på OK. Klicka på Rader, avmarkera Visa endast på huvudnivåer och markera Dölj alla. Klicka sedan på OK. Högerklicka på diagrammet och välj Exportera diagram…. Spara bilden på den angivna sökvägen. Använd MATLAB för att beräkna dipolcellens dragkraft. Spara textfilen för traktionsdata (från steg 8.1.12) och roi-koordinatfilen (cellgränsområde) (från steg 7.1.9) i samma mapp som definieras i steg 8.1.12. Överför alla MATLAB-filer som finns på plats i AMFIP-paketet till den här mappen. Öppna MATLAB. Öppna mappen som definieras i steg 8.1.12 och öppna funktionen absdipole för dipole.m som överförs till den här mappen i steg 8.3.1. Läs de två text-csv-filerna i steg 8.3.1 i MATLAB:s arbetsutrymme och tilldela en matris till två variabler (t.ex. dragkraft och roi). Kör funktionen absdiple (traction,roi).OBS: Den första kolumnen i utgången är dipolens dragkraft i nN (nano-Newton). Den andra kolumnen i utgången är vinkeln på dipolens dragkraft med avseende på den horisontella axeln.

Representative Results

Distinkt YAP-distribution och dynamik i CRISPR/Cas9-konstruerad PC9-cancer och B2B normala celler under cellspridningRepresentativa fluorescensbilder av YAP-fördelning i enstaka B2B- och PC9-celler på 2, 5, 40 kPa PAA-geler och glasöverdrag visas i figur 1A och figur 2A. Den nukleära lokaliseringen av YAP i B2B-celler ökade med ökande substratstelhet (figur 1A), medan PC9-celler visade liknande YAP-koncentration i kärnan och cytoplasman på substrat med varierande styvhet (figur 2A). Representativa fluorescensbilder av YAP-fördelning i enstaka, spridande B2B- och PC9-celler på 5 kPa hydrogelsubstrat (från 0: e h till 10: e h efter cellerna som fästs vid substraten) visas i figur 1B respektive figur 2B. B2B-cellen ökade monotont spridningsområdet över tiden tillsammans med en minskning av YAP N/C-förhållandet (figur 1B), medan PC9-cellen bibehöll ett jämförelsevis oföränderligt cellspridningsområde, orientering och YAP N/C-förhållande under hela spridningsprocessen på 10 h (figur 2B). Under den 10 h långa varaktigheten av tidig spridning deformerade den representativa B2B-cellen konstituerande substratytan och applicerade tidsförbdröjande celldragkraft över hela cellområdet (figur 1C och figur 1D). Däremot utvecklade den representativa PC9-cellen endast förskjutning och dragkraft i cellkroppens två ändar och dess dragkraft minskade efter 7,5 h (figur 2C och figur 2D). Fler timelapse-bilder och traktionsmätningar av B2B- och PC9-celler i det tidiga spridningsstadiet tillhandahålls i kompletterande figur S2 och kompletterande figur S3. Andra lägen för PC9-celldynamik observerades också (figur 6). Parallellt med dessa olika spridningsegenskaper visade B2B- och PC9-celler distinkt YAP-fördelning och dynamik (figur 3). På en 5 kPa gel, YAP i B2B celler var koncentrerad i kärnan vid 0th h och blev mer homogent fördelade över cell kroppen vid 10: e h. PC9 celler visade dock en mer homogen fördelning av YAP i kärnan och cytoplasma under hela 10 h av spridningsprocessen. För att kvantitativt analysera YAP-aktiviteten och flyttningen i B2B- och PC9-celler beräknades YAP N/C-förhållandet med hjälp av algoritmen som beskrivs i figur 4. För att ytterligare undersöka den distinkta YAP-dynamiken jämfördes temporala förändringar i YAP N/C-förhållandet, cell/kärnan och dragkraften hos flera enskilda B2B-celler (n = 10) och PC9-celler (n = 5) (figur 5). Det konstaterades att det genomsnittliga YAP N/C-förhållandet för B2B-celler minskade från 2,54 ± 0,22 till 1,79 ± 0,21 (n = 10; p = 0,0022**; Figur 5A), medan det genomsnittliga YAP N/C-förhållandet för PC9-celler ändrades från 1,92 ± 0,26 till 1,57 ± 0,07 (n = 5; p = 0,187 (ej signifikant (ns)). Figur 5A). Den genomsnittliga dipoldragkraften hos B2B-celler ändrades från 256,17 ± 123,69 nN till 287,44 ± 99,79 nN (p = 0,7593 (ns); Figur 5B). Den genomsnittliga dipoldragkraften hos PC9-celler ändrades från 141,19 ± 33,62 nN till 168,52 ± 73,01 nN (p = 0,7137 (ns); Figur 5B). B2B-cellernas genomsnittliga cellspridningsområde ökade från 613,89 ± 102,43 μm2 till 942,51 ± 226,71 μm2 (p = 0,0512 (ns); Bild 5C). Den genomsnittliga cellspridningsområdet för PC9-celler ändrades från 495,78 ± 97,04 μm2 till 563,95 ± 89,92 μm2 (p = 0,5804 (ns); Bild 5C). B2B-cellernas genomsnittliga kärnspridningsområde ökade från 181,55 ± 36,18 μm2 till 239,38 ± 43,12 μm2 (p = 0,1217 (ns); Bild 5D) och den genomsnittliga kärnspridningsområdet för PC9-celler ändrades från 133,31 ± 30,05 μm2 till 151,93 ± 22,49 μm2 (p = 0,5944 (ns); Figur 5D). Dessa resultat tyder på att (1) B2B celler visar en konstituerande substrat-styvhet-beroende YAP N/C förhållande; (2) B2B-cellernas dragkraft är högre än pc9-cellernas. och (3) I motsats till B2B-celler visar PC9-celler en begränsad ökning av cellområdet och förändringar i YAP N/C-förhållandet under spridningsprocessen på 10 timmar. Korrelation mellan YAP-distribution och dynamik och migreringstillstånden för B2B-cellerYAP N/C-förhållande och dipoldragkraft för alla B2B (n=10) och PC9 (n=5) celler som en funktion av cellspridningsområde och kärnan spridningsområde jämfördes. YAP N/C-förhållandet och dipoldragkraften hos PC9-celler korrelerade inte tydligt med deras små cell- och kärnans spridningsområde (figur 6). YAP N/C-förhållandet och dipoldragkraften hos B2B-celler tycktes däremot följa två distinkta trender (figur 6A och figur 6C), vilket tyder på att det kan finnas två grupper av B2B-celler som samexisterar i detta experiment. I den första gruppen ökar YAP N/C-förhållandet och dipoldragkraften tillsammans med utvidgningen av cellspridningsområdet och når deras maxima vid ~ 1000 μm2 (figur 6C och figur 6D, indikerad av den gula streckade linjen). I den andra gruppen ökar YAP N/C-förhållandet och dipoldragkraften i långsammare takt med utvidgningen av cellspridningsområdet och upprätthåller nästan konstanta värden när cellspridningsområdet fortsätter att öka (figur 6C,D, indikerat av den gröna streckade linjen). PC9 cancerceller genererar dragkrafter i peri-nukleära regionerEnstaka, spridande PC9-celler förskjuter substraten i de peri-nukleära regionerna, från och med 6: e h av kulturen (figur 7C). För att visualisera den peri-nukleära förskjutningen orsakad av celldragkraft överlappade vi bilderna av fluorescerande pärlor tagna före (röda) och efter (grön) avlägsnandet av cellerna från substraten (se protokollavsnittet för detaljer). Pärlor som inte har någon förskjutning kommer att visas gula i de överlappande bilderna, dvs. tillägg av röda och gröna färger. Däremot kommer pärlor som förskjuts från sina vilopositioner på grund av celldragkraft att visa separerade gröna och röda färger. I både PC9-celler (figur 7C, D) och B2B (figur 7E) observerades pärlförskjutning i cytoplasma och i kärnan, utöver dem vid cellgränsen. För att markera peri-nuclear förskjutningen används Boussinesq-ekvationen från linjär elasticitetsteori för att förutsäga den 2D-teoretiska förskjutningen som genereras av en hypotetisk dipolkraft vid cellgränsen (svart streckad linje i figur 7B)24. Genom att jämföra denna teoretiska kurva med den verkliga substratförskjutningen mätt längs samma axel (vit streckad linje i figur 7D) konstaterades de verkliga förskjutningarna i kärnan vara 1,5-8 gånger större än det teoretiska värdet (figur 7B), vilket indikerar förekomsten av dragkraft i de peri-nukleära regionerna. Figur 1: Förändringar i YAP-uttryck/-fördelning, substratförskjutningsfält och dragkraftsfält för en B2B-normalcell på substrat med varierande styvhet och vid tidig spridning. (B) B2B-cellen såddes på en 5 kPa PAA-gel och avbildades över 10 h efter den första cellsubstratfästet. YAP-uttryck representeras av grön fluorescensintensitet. Obs: YAP-intensiteten inuti kärnan minskar gradvis men förblir högre än i cytoplasman över tiden. Färgstaplarna anger nivåerna för YAP-uttryck (grön = högt uttryck; svart = lågt uttryck) i (A) och (B). (C) Substratdeformation (överlappad med ljusfältsbilden) på cellplatsen representeras av förskjutningsfältet vid varje tidpunkt. Förskjutningsriktning och magnitud visas av pilens respektive färg. Förskjutningen blir större i ändarna av B2B-cellkroppen när cellspridningsområdet ökar. Färgfältet anger förskjutningsstorlek (crimson = hög magnitud; svart = låg magnitud). (D) Traktionsfält (överlappat med ljusfältsbilden) beräknat från förskjutningsfältet. Dragkraften är koncentrerad till gränsen för B2B-cellerna. De vita och gula prickade konturerna avgränsar cellens respektive kärnans gränser. Färgfältet anger dragkraftsstorlek (crimson = hög magnitud; svart = låg magnitud). Skalstänger = 20 μm. Förkortningar: YAP = Ja-associerat protein; PAA = polyakrylamid. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 2: Förändringar i YAP-uttryck/-distribution, substratförskjutningsfält och traktionsfält för en PC9-cancercell på substrat med varierande styvhet och vid tidig spridning. A) YAP-uttrycket för en PC9-cell sådd på 2, 5 och 40 kPa PAA-geler och glasöverdrag efter 65 timmar från den ursprungliga cellsubstratfästet. (B) PC9-cellen såddes på en 5 kPa PAA gel och avbildades över 10 h efter inledande cell-substratfäste. YAP-uttryck representeras av grön fluorescensintensitet. Obs: YAP-intensitetsplatåerna från 1,5 timmar och framåt. Färgstaplarna anger nivåerna av YAP-uttryck (grön = högt uttryck; svart = lågt uttryck) i (A) och (B). (C) Substratdeformation (överlappad med ljusfältsbilden) på cellplatsen representeras av fluorescerande pärlans förskjutningsfält vid varje tidpunkt. Förskjutningsriktning och magnitud visas av pilens respektive färg. Förskjutningsfältet som orsakas av PC9-celler är mindre än det som orsakas av B2B-cellen. Under hela 10 h spridningsprocessen förblir området pc9-celler nästan konstant. Färgfältet anger förskjutningsstorlek (crimson = hög magnitud; svart = låg magnitud). (D) Traktionsfält (överlappat med ljusfältsbilden) beräknat från förskjutningsfältet. Dragkraften som genereras av denna representativa PC9-cell minskar gradvis från 6: e h till 10: e h. De vita och gula prickade konturerna avgränsar cellens respektive kärnans gränser. Färgfältet anger dragkraftsstorlek (crimson = hög magnitud; svart = låg magnitud). Skalstänger = 20 μm. Förkortningar: YAP = Ja-associerat protein; PAA = polyakrylamid. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 3: YAP-fördelning i B2B- och PC9-celler i det tidiga spridningsstadiet. A) B2B-cellens YAP-intensitet mäts längs den tilldelade röda axeln vid den 0:e och 10:e h. (B) Vid 0:e h visar YAP-intensiteten dramatiska koncentrationsskillnader mellan kärnan och cytoplasma. Vid 10: e h blir YAP-intensiteten mer homogen över hela cellkroppen. C) YAP-intensiteten hos PC9-cellen mäts längs den tilldelade blå axeln vid den 0: e och 10: e h. (D) Vid 0: e h verkar YAP-intensiteten i kärnan högre än i cytoplasma, även om skillnaden inte är lika anmärkningsvärd som i B2B-celler. Vid 10: e h verkar YAP-intensiteten i kärnan fortfarande något högre än i cytoplasma, med en variation trend som liknar den vid 0: e h. Skalstänger = 20 μm (A, C). Förkortning: YAP = Ja-associerat protein. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Bild 4: Mätning av YAP N/C-förhållandet. (1) Applicera Fiji ImageJ för att rita konturen av kärnan och mäta dess 2D-projicerade område Anuc. (2) Mät fluorescensintensiteten inuti kärnan Inuc. (3) Rita konturen av cellkroppen och mät dess projicerade område Acel. (4) Mät fluorescensintensiteten inuti cellen Icel. (5) Beräkna YAP-kärnans densitet Dnuc, YAP cytoplasmatäthet Dcyto och deras förhållande R: Dnuc=Inuc/Anuc; Dcyto=(Icel-Inuc)/(Acel-Anuc); R=Dnuc/Dcyto. Färgfältet anger nivåerna för YAP-uttryck (grönt = högt uttryck; svart = lågt uttryck). Skalstång = 20 μm. Förkortningar: YAP = Ja-associerat protein; N = kärna; C = cytoplasma. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 5: Distinkt YAP-uttryck, cell/nucleus morfologi och cellulär dragkraft i PC9-cancer och B2B normala celler under cellspridning. A) YAP N/C-förhållandet ändras under de första 10 h av encellsspridning. Det genomsnittliga YAP N/C-förhållandet för B2B-celler (röd kolumn; n = 10) ändrades från 2,54 ± 0,22 till 1,79 ± 0,21 (n = 10; p = 0,0022**) medan det genomsnittliga YAP N/C-förhållandet för PC9-celler (blå kolumn; n = 5) ändrades från 1 ±,92 ± 0,92 ± 0,92 ± 0,92 (B) Den genomsnittliga dipoldragkraften som en funktion av tiden. Den genomsnittliga dipoldragkraften hos B2B-celler ändrades från 256,17 ± 123,69 nN till 287,44 ± 99,79 nN (p = 0,7593 (ns)) och den genomsnittliga dipoldragkraften hos PC9-celler ändrades från 141,19 ± 33,62 nN till 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,52 ± 168,5 C) Det genomsnittliga cellområdet som en funktion av tiden. B2B-cellernas genomsnittliga cellspridningsområde ökade från 613,89 ± 102,43 μm2 till 942,51 ± 226,71 μm2 (p = 0,0512 (ns)) och den genomsnittliga cellspridningsområdet för PC9-celler ändrades från 495,78 ± 97,04 μm2 till 563,95 ± 89,92 μm2 (p = 0,5804 (ns)). D) Det genomsnittliga kärnområdet som en funktion av tiden. B2B-cellernas genomsnittliga kärnspridningsområde ökade från 181,55 ± 36,18 μm2 till 239,38 ± 43,12 μm2 (p = 0,1217 (ns)) och PC9-cellernas genomsnittliga kärnspridningsområde ändrades från 133,31 ± 30,05 μm2 till 151,93 ± 22,49 μm2 (p = 0,5944 (ns)). Förkortningar: YAP = Ja-associerat protein; N = kärna; C = cytoplasma; ns = inte signifikant. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 6: YAP N/C-förhållande och dipolkraft som en funktion av spridningsområdet för cell och kärna. YAP N/C-förhållande och dipoldragkraft hos B2B-celler (n=10) och PC9-celler (n=5) beräknas från 6:e h till 10:e h efter fastsättning på substrat. A) YAP N/C-förhållande som en funktion av cellspridningsområdet. YAP N/C-förhållandet för B2B-celler varierar från 1,16 till 2,53, medan YAP N/C-kvoterna för PC9-celler varierar från 1,27 till 1,88. Cellspridningsområdet för B2B-celler varierar från 391,94 μm2 till 1986,40 μm2. Cellspridningsområdet för PC9-celler varierar från 284,46 μm2 till 830,12 μm2. B) YAP N/C-förhållande som en funktion av kärnans spridningsområde. Kärnans spridningsområde för B2B-celler varierar från 107,09 μm2 till 514,28 μm2. Kärnspridningsområdet för PC9-celler varierar från 58,03 μm2 till 259,65 μm2. Dipoldragkraft hos B2B-celler som en funktion av cellspridningsområdet (C) och kärnans spridningsområde (D). Spridning och icke-migrerande B2B-celler visar högre dragkraft (från 47,50 nN till 1051,48 nN) med nedre cell- och kärnanal. Vid spridning och migrerande visar B2B-celler lägre dragkraft (från 105,80 nN till 310,28 nN) med större områden av cell- och kärnanal. Förkortningar: YAP = Ja-associerat protein; N = kärna; C = cytoplasma. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 7: Peri-nukleär förskjutning i normala B2B- och cancer-PC9-celler. A) Schematiskt sidovydiagram över peri-nukleär och pericellförskjutning mätt från pärlförskjutning i substratet. (B) Substratförskjutning under PC9-cellen mäts längs cellaxeln (vit streckad linje i 7D). Den teoretiska förskjutningen som genereras av dipolkraften vid cellgränsen visas av Boussinesq-ekvationen (svart streckad kurva). (C) och (D) Överlappande fluorescerande pärla bilder med (röd) och utan (gröna) celler för PC9-cellerna vid 6: e h efter fastsättning (övervy). Gula (exakt överlappning av röda och gröna färger) pärlor indikerar ingen förskjutning. De separerade gröna och röda pärlor (spetsade med gula pilar) representerar peri-nukleära förskjutningen. Gula pilar indikerar dessa kontrakterade peri-nucleus fläckar som ligger vid kärnans periferi. (E) Peri-nukleär deplacement som genereras av B2B-cellen vid 1,5 timme efter cellsubstratfäste. Skalstänger = 10 μm (C–E). Klicka här för att se en större version av den här figuren. Kompletterande figur S1: Den genomiska sekvenskartan för YAP-mNeonGreen21-10/11. Klicka här för att ladda ner den här filen. Kompletterande figur S2: Förändringar i YAP-uttryck/-distribution, substratförskjutningsfält och traktionsfält för B2B-normala celler vid tidig spridning. (A, D, G, J, M) B2B cellen såddes på en 5 kPa PAA gel och avbildas över 10 h efter den första cell-substrat tillbehör. YAP-uttryck representeras av grön fluorescensintensitet. Obs: YAP-intensiteten inuti kärnan minskar gradvis men förblir högre än i cytoplasman över tiden. Färgstaplarna anger nivåerna för YAP-uttryck (grön = högt uttryck; svart = lågt uttryck) i (A, D, G, J, M). (B, E, H, K, N) Substratdeformation (överlappad med ljusfältsbilden) på cellplatsen representeras av förskjutningsfältet vid varje tidpunkt. Förskjutningsriktning och magnitud visas av pilens respektive färg. Förskjutningen blir större i periferin av B2B-cellkroppen när cellspridningsområdet ökar. Färgstaplarna anger förskjutningsstorlek (crimson = hög magnitud; svart = låg magnitud) i (B, E, H, K, N). (C, F, I, L, O) Traktionsfält (överlappat med ljusfältsbilden) beräknat från förskjutningsfältet med traction force microscopy. Dragkraften är koncentrerad i periferin av B2B-celler. Färgstaplarna anger dragkraftsstorlek (crimson = hög magnitud; svart = låg magnitud) i (C, F, I, L, O). Skalstänger = 20 μm. Förkortningar: YAP = Ja-associerat protein; PAA = polyakrylamid. Klicka här för att ladda ner den här filen. Kompletterande figur S3: Förändringar i YAP-uttryck/-distribution, substratförskjutningsfält och traktionsfält för PC9-cancerceller under tidig spridning. (A, D, G, J) PC9 cellen såddes på en 5 kPa PAA gel och avbildas över 10 h efter den första cell-substrat tillbehör. YAP-uttryck representeras av grön fluorescensintensitet. Obs: YAP-intensiteten inuti kärnan minskar gradvis men förblir lik eller något lägre än i cytoplasman över tiden. Färgstaplarna anger nivåerna för YAP-uttryck (grön = högt uttryck; svart = lågt uttryck) i (A, D, G, J). (B, E, H, K) Substratdeformation (överlappad med ljusfältsbilden) på cellplatsen representeras av förskjutningsfältet vid varje tidpunkt. Förskjutningsriktning och magnitud visas av pilens respektive färg. Förskjutningen blir större i periferin av PC9-cellkroppen när cellspridningsområdet ökar. Färgstaplarna anger förskjutningsstorlek (crimson = hög magnitud; svart = låg magnitud) i (B, E, H, K). (C, F, I, L) Traktionsfältet (överlappat med ljusfältsbilden) beräknat från förskjutningsfältet. Dragkraften är koncentrerad i periferin av PC9-celler. Färgstaplarna anger dragkraftsstorlek (crimson = hög magnitud; svart = låg magnitud) i (C, F, I, L). Skalstänger = 20 μm. Förkortningar: YAP = Ja-associerat protein; PAA = polyakrylamid. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Avbildningsprocessen (steg 6.3) är avgörande för att säkerställa att fluorescensbilderna är av tillräckligt god kvalitet för att ge giltiga kvantifieringsresultat. Z-stack-bilderna av fluorescerande protein eller pärlor bör ha ett z-intervall som är tillräckligt stort för att inkludera in-focus-bilderna för alla Z-positioner som provet sträcker sig över. Ett annat kritiskt steg är att samla referensbilder av fluorescerande pärlor efter upplösning av cellerna (steg 6.5). Eftersom referensbilderna måste tas i samma positioner i steg 6.3 bör ingen relativ förskjutning induceras mellan Petri-skålen, miljökammaren och mikroskopet. Utredarna som utför upplösningssteget måste vara noga med att ta bort locket på Petri-skålen och se till att den applicerade mekaniska störningen inte är tillräckligt stor för att ändra skålens placering i miljökammaren.

Nedan finns lösningar för att lösa vissa fel som kan uppstå under experiment. Om inget makro har aktiverats efter att du klickat på Retur i steg 6.4 beror det troligtvis på att den vänstra nedre delen av skärmen upptas av ett icke-elementfönster. I så fall måste fönstrets vänstra nedre område rensas så att makron kan aktiveras i Element. Ett annat vanligt fel är att ljusfältsbilderna visas svarta. Det här problemet orsakas av ett otillräckligt tidsintervall mellan förvärven av fluorescens- och ljusfältsbilder. Små förseningar i fluorescensavbildningstiden kan ackumuleras med tiden och orsaka betydande förseningar och störa ljusfältsavbildningen. En lösning är att justera varaktigheten för en bildcykel för alla positioner så att den är mindre än (inte lika med) tidsintervallet mellan starten av på varandra följande rörelser. Den här åtgärden uppdaterar tidsräkningen och eliminerar det kumulativa felet i början av varje avbildningscykel.

Denna helt optiska förhörsteknik stöder (1) ett brett utbud av hårdvara / programvara, inklusive men inte begränsat till Nikon, (2) olika typer av validerade hydrogelsystem, inklusive gelatin, PEG, Matrigel och kollagen I geler, och (3) den programmerbara anpassningen baserat på olika behov hos forskare. Men om någon av kontrollfunktionerna på bottennivå inte är tillgängliga från ett kommersiellt mikroskop blir anpassningen av funktionerna med AMFIP utmanande. En annan begränsning av denna teknik är provets rumsliga drift i både XY- och fokusplanerna (Z). Även om denna begränsning kan övervinnas under efterbehandlingen av bilderna, är det viktigt att förbättra autofokusfunktionen för att korrigera provernas drift i realtid. Denna förbättring kommer att öka genomströmningen av avbildningsprocessen och minska det potentiella felet som orsakas av avdriften under experiment.

Mekanotransducers, såsom YAP, kan fungera som nya terapeutiska mål för utveckling av lovande cancerbehandlingar25,26,27. Nya data tyder på att YAP främjar spridning och invasion av cancerceller. Mekanikinducerad YAP-flyttning från cytoplasman till kärnan aktiverar transkription av gener relaterade till cellmigration, spridning, invasion och apoptos, vilket leder till avvikande cellbeteenden28,29,30,31. Detta arbete syftade till att utforska den potentiella korrelationen mellan YAP N/C-förhållandet och cellmekaniken i två typiska mänskliga lungcancer och normala cellinjer. Under spridningsperioden på 10 h visar PC9-celler liknande YAP-koncentrationer i kärnan och cytoplasman (figur 3D och figur 5A). B2B-celler visar en högre YAP-koncentration i kärnan än i cytoplasman (figur 3C och figur 5A). Detta förhållande som hittades under det tidiga spridningsstadiet skiljer sig från majoriteten av publicerade resultat som jämför YAP-koncentrationen i kärnan mellan normala och cancerceller. Även om det inte nödvändigtvis är i det tidiga spridningsstadiet, visar de flesta publicerade resultat att YAP är mer koncentrerat i kärnan av cancerceller än i kärnan av normala ^celler27,28. Endast en studie om bröstcancer rapporterade ett ^undantag32 som visar att YAP är mer koncentrerat i cytoplasman, vilket överensstämmer med våra nuvarande observationer gjorda i lungcancer PC9-celler. Såvitt författarna vet är detta arbete det första som visar ett lägre YAP N/C-förhållande i en mänsklig lungcancercelllinje. Författarna hypotesen att orsaken till ett stabilt YAP N/C-förhållande i PC9 celler kan bero på den låga variationen i cellen /kärnan spridning område och dragkraft i PC9 celler i det tidiga spridningsstadiet. Dissekering av de underliggande molekylära mekanismerna för lågt YAP N/C-förhållande i PC9- och B2B-celler pågår.

Under de första 10 h av spridning visar dessa två cellinjer ett distinkt samband mellan YAP N/C-förhållandet, celldragkraften och spridningsområdet (figur 5). För B2B-celler är ett högre YAP N/C-förhållande korrelerat med ett högre cell- och kärnans spridningsområde (figur 6A, B), vilket överensstämmer med rapporterade data från andra normala ^celler33. Intressant, även om utvecklingstrenden för detta förhållande i allmänhet finns i alla B2B-celler registrerade, finns två olika grader (hög och låg) av detta förhållande. B2B-celler som sprider sig och migrerar samtidigt visar lägre dragkraft och högre cell- och kärnans spridningsområde med ett högre YAP N/C-förhållande (2,05 ± 0,32). För B2B-celler som sprider sig och förblir på samma plats visar de högre dragkraft och nedre cell- och kärnan spridningsområde med ett lägre YAP N/C-förhållande (1,74 ± 0,21). Dessa två grader av relationer visas i de förgrenade spridda datagrupperna (figur 6C,D). Som rapporterats i litteraturen har stationära normala celler, såsom embryonala fibroblast NIH 3T3 celler, högre dragkraft än flyttande ^celler34. De data som rapporteras i detta dokument tyder på att spridning och icke-migrerande B2B celler tillämpas högre dragkraft än spridning och migrerande B2B celler, vilket sannolikt tyder på att hög dragkraft behövs för icke-migrerande celler att stabilisera på substratet.

Dessutom visar dessa data att stationära normala B2B-celler genererar en högre periferi-nukleär kraft, medan tidigare forskning utförd av andra forskare rapporterade endast högre celldragkraft som genereras i periferin av stationära celler34,35,36,37. Författarna tror att skillnaden i den inneboende tendensen till migration i experimenten kan orsaka dessa motstridiga resultat. I de publicerade experimenten hade kvadratformad mikropapper använts för att begränsa enstaka celler från att sprida och hämma migration. om cellerna hade en tendens att migrera är okänt. Eftersom flyttande celler ofta visar hög dragkraft i periferin av ^cellerna38, är det troligt att celler med tendens att migrera fortfarande kommer att upprätthålla hög periferi dragkraft även om deras migrering är begränsad. I denna nuvarande studie är de stationära cellerna inte begränsade av någon micropattern men migrerar inte, vilket indikerar att cellerna tenderar att upprätthålla sitt icke-migrerande tillstånd. En annan möjlighet är att den cellform som definieras av mikropattern kan påverka fördelningen av fokala vidhäftningar och ^{dragkraftkrafter39}. Resultaten i denna studie genererades utan någon begränsa micropatterning och representerar kraftfördelningen av stationära celler i sin ursprungliga form.

Såvitt författarna vet, endast en publikation hittills rapporterade specifikt konstaterandet av peri-nukleära krafter i normala celler (mus embryonala fibroblaster), potentiellt orsakas av aktinlocket som sträcker sig över ^kärnan40. YAP cytoplasma-till-kärna flyttning är korrelerade med ökningen av ^{peri-kärnkraft40}. En grundlig sökning av den relevanta litteraturen gav inte några publikationersom rapporterar en peri-nukleär kraft eller aktinlocket i cancerceller. En indirekt studie på melanom cancerceller visade att aktin rim (en annan peri-nukleär aktin organisation som ligger runt men inte täcker kärnan) minskar cellmigrationshastigheten41, vilket indirekt tyder på förekomsten av en peri-nukleär kraft. Inga direkta experimentella data rapporteras dock. I denna studie fann författarna att både PC9 och B2B celler visar peri-nukleära förskjutning och dragkraft. Mekanismerna för genereringen av de peri-nukleära styrkorna och deras effekter är fortfarande kontroversiella. I normala celler rapporterades aktinlocket spela en roll i regleringen av kärnan morfologi och kromatin ^{organisation42}, överföra mekaniska signaler från fokal vidhäftningar till kärnan genom länkar av nukleoskelett och cytoskeleton (LINC) ^komplex43 och reglera cell ^migration44. Lamin A/C är relaterat till bildandet och störningen av aktintaket40,41,42,43,44. I den rapport som hävdade att actintaket genererar en peri-nukleär styrka beaktade man dock inte aktin ^rim40:s potentiella roll. I cancerceller underlättar överuttryck av Lamin A bildandet av en aktinkant och begränsar cancercellsmigration. Överuttryck av Lamin B minskar aktin rimbildning och främjar migration. Den peri-nukleära styrkan kan vara involverad i denna process på grund av förekomsten av peri-nukleär aktinorganisation och effekten av Lamin A. Resultaten av denna studie visade dock inga tecken på uppmätta peri-nukleära styrkor eller beteendet hos aktinlocket. Därför är upptäckten av peri-nukleära krafter i PC9-celler i denna nuvarande studie den första rapporten som visar peri-nukleära krafter och förskjutningar i lungcancerceller. Författarna undersöker för närvarande de molekylära mekanismerna och funktionerna hos peri-nukleära krafter i CRISPR/ Cas9-konstruerade PC9- och B2B-celler.

Utöver det helt optiska mekanobiologiförhör som demonstreras i detta dokument kan det integrerade multifunktionella systemet tillämpas för att optiskt undersöka en myriad av andra väsentliga fysiologiska och patobiologiska signaler i levande system. Författarnas laboratorium har till exempel nyligen etablerat flera stabilt transduced mänskliga cancer cellinjer som co-express tre ljus-lyhörda membran proteiner: membranspänningsindikator QuasAr2 (excitation: 640 nm; utsläpp: 660 nm-740 nm), membranspänning depolarizer CheRiff (excitation: 488 nm) och membranspänning hyperpolarizer eNpHR3 (excitation: 590 nm). Dessa tre funktionella proteiner kan aktiveras av spektrum-ortogonala laserlinjer på ett crosstalk-fritt sätt, vilket möjliggör helt optisk tvåvägssignaleringskommunikation (avläsning och kontroll) av membranelektrofysiologi. Med hjälp av ett integrerat opto-elektroniksystem och en manuell patch-clamp, författarna har validerat den helt optiska kontrollen och avläsningen av membranspänningen (_Vm) i enstaka mänskliga cancerceller och multicellulära tumör sfäroider. Det helt optiska elektrofysiologiska förhöret öppnar möjligheten för detaljerade utforskningar av tidigare otillgänglig bioelektriskitet i cancerceller, vilket kan bidra till att främja tumörbiologi från en ny axel.

Materials

(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-aldrich	440140
0.05 % Trypsin	Corning	25-051-CI
75 cm2 flask	Corning	430641U
8 Benchtop Centrifuge	Thermo	75007210
A1R confocal system	Nikon	HD25
Acetic acid	Sigma-aldrich	695092	glacial, ACS reagent, ≥99.7%
BEAS-2B (B2B) cells	Sigma-aldrich	95102433	human epithelial cells from lung tissue
Carboxylate-Modified Microspheres	Invitrogen	F8797
Culture medium (RPMI-1640)	Gibco	11875093
Desktop Computer	Dell	2018	with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZB	Tokai Hit	TIZB
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	26140
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fiji ImageJ	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation	1.53k
Glass-bottom petri dish	MatTek	P35G-1.5-14-C
HEPES buffered saline	Sigma-aldrich	51558
Hydrazine hydrate solution	Sigma-aldrich	53847
IntelliJ IDEA	JetBrains	2020	Java development platform
Java Development Kit	Oracle	14.0
Kimwipe	Kimtech Science	3066-05
MATLAB	MathWorks	2020b
Monochrome Camera	FLIR	BFS-U3-70S7M-C
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza	LT07-218
N,N′-Methylenebisacrylamide solution	Sigma-aldrich	M1533
NIS-Elements software platform	Nikon	4.50	software platform
Origin	OriginLab	OriginPro 2017 (Learning Edition)	data analysis and graphing software
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
PC9 cells	Sigma-aldrich	90071810	human adenocarcinoma cells  from lung tissue
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010023
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	F-553S	high-fidelity DNA polymerase
Scotch tape	Scotch		adhesive tape
Sodium dodecyl sulfate solution	Sigma-aldrich	05030
Super glue	Gorilla		cyanoacrylate glue
Ti2-E inverted microscope	Nikon	MEA54000
TI2-S-SE-E Motorized Stage with Encoder	Nikon	MEC56120
μManager		version 2.0 gamma	open source microscopy software (https://micro-manager.org/)