Çok Fonksiyonlu Bir Sistem Kullanarak İnsan Kanseri ve Normal Hücrelerde Evet İlişkili Proteinin Tamamen Optik Mekanobiyoloji Sorgulaması
Summary
Bu makalede, Otomatik çok kanallı görüntüleme ve mekanobiyolojik analizin Evet ilişkili proteinin (YAP) mekano duyarlılığını aydınlatmasını sağlayan entegre çok fonksiyonlu ve kullanıcı tarafından programlanabilir bir sistemin nasıl kullanılabileceğine dair ayrıntılı bir adım adım protokol sunulmaktadır.
Abstract
Canlı hücrelerin uzun süreli çok fonksiyonlu görüntüleme ve analizi, çeşitli donanım ve yazılım platformlarının kolaylaştırılmış, işlevsel koordinasyonunu gerektirir. Bununla birlikte, farklı üreticiler tarafından üretilen çeşitli ekipmanların manuel kontrolü emek yoğun ve zaman alıcıdır ve elde edilen verilerin doğruluğunu, tekrarlanabilirliğini ve kalitesini potansiyel olarak azaltır. Bu nedenle, otomatik, çok işlevli ve uzun süreli görüntü alımını sağlayan ve çoğu floresan mikroskopi platformuyla uyumlu, hepsi bir arada ve kullanıcı tarafından programlanabilir bir sistem bilim camiasına fayda sağlayabilir. Bu makale, (1) otomatik çok kanallı görüntüleme alımını sağlayan “Otomatik Çok fonksiyonlu Entegrasyon Programı (AMFIP)” başlıklı ev yapımı bir yazılım programından ve (2) nicel görüntüleme analizi ve hücre çekiş hesaplama paketlerinden oluşan yeni bir entegre yazılım sisteminin kullanılmasının tam çalışma protokollerini tanıtır.
Bu entegre sistem, CRISPR/Cas9 tarafından tasarlanmış insan normal hücrelerinde (B2B) ve akciğer kanseri hücrelerinde (PC9) mechano duyarlı Evet ilişkili proteinin (YAP) mekansal-zamansal dağılımı ile hücre yayılımı ve çekiş dahil hücre mekaniği arasındaki daha önce bilinmeyen ilişkiyi ortaya çıkarmak için uygulanmaktadır. Bu sistemin çok kanallı kontrol ve okuma yeteneğinden yararlanan sonuç şunları göstermektedir: (1) B2B normal hücreler ve PC9 kanser hücreleri, hücre yayma ve geçiş işlemleri sırasında YAP ekspresyonu, çekiş ve hücre dinamikleri arasında ayrı bir ilişki gösterir; ve (2) PC9 kanser hücreleri substratlara gözle görülür peri-nükleer kuvvetler uygular. Özetle, bu makale, YAP mekano duyarlılığını aydınlatmak için otomatik çok fonksiyonlu görüntüleme ve analiz sağlayan entegre bir kullanıcı programlanabilir sistemin nasıl kullanılabileceğine dair ayrıntılı bir adım adım protokol sürmektedir. Bu araçlar, hücre fizyolojisi ve patolojisi bağlamında çok yönlü sinyal dinamiklerinin ayrıntılı keşfine imkan açar.
Introduction
Bu yöntemin genel amacı, tüm optik çok fonksiyonlu görüntüleme ve canlı hücrelerin analizini sağlamaktır. Çok fonksiyonlu optoelektronik cihazların otomatik koordinasyonunu sağlayan hepsi bir arada görüntüleme programı, emek yoğun ve hataya açık manuel işlemleri azaltacaktır ve araştırmacıların uzun süreli canlı hücre görüntülemesi yapması için gereklidir1,2,3,4. Bununla birlikte, biyomedikal araştırma topluluğundaki mevcut kamu programlarının çoğu ya sadece sınırlı optoelektronik cihazlar için geçerlidir ya da farklı ekipmanların koordinasyonu için ek donanım gerektirir5,6,7,8,9. Son zamanlarda, çok kanallı ve hızlandırılmış görüntülemeyi mümkün kılacak “Otomatik Çok fonksiyonlu Entegrasyon Programı (AMFIP)” başlıklı açık kaynaklı ve yazılım tabanlı bir program geliştirilmiştir. Java diline ve μManager11,12’lik Uygulama Programlama Arabirimi’ne (API) dayanan AMFIP, Nikon’dan gelenler de dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere birden fazla optoelektronik donanım ve yazılım platformunun yazılım tabanlı iletişimlerini gerçekleştirmek için özelleştirilmiş Java komut dosyaları yürüten bir eklenti olarak geliştirilmiştir. AMFIP’nin kurulması, hücre davranışlarının programlanabilir ve çok fonksiyonlu sorgulanma olasılığını açar. Bu makalede entegre bir deneysel ve hesaplama sistemi geliştirilmiştir ve AMFIP ile dijital görüntüleme analizi ve hücre çekiş kuvveti mikroskopisini birleştirir. Sistem, CRISPR/Cas9 tarafından tasarlanmış insan normal B2B (Şekil 1) ve akciğer kanseri PC9 (Şekil 2) hücre hatlarında belirgin YAP mekanobiyolojisinin aydınlatıcısını sağlar. Sistem, bilim topluluğuna, her görüntüleme sistemi için mevcut olmayan ve/veya uyumlu olabilecek ek kontrol cihazları satın alma talebini önleyen kapsamlı bir çözüm sunar.
Bu makalede sunulan protokoller, (1) mNEonGreen2 etiketli YAP’ı ifade eden crispr/cas9 tarafından tasarlanmış hücre hatları için otomatik uzun süreli görüntüleme yapmak için AMFIP’nin nasıl uygulanacağını tanıtır; ve (2) Floresan yoğunluklarına (Şekil 3 ve Şekil 4), hücresel yer değiştirme alanına (Şekil 1C ve Şekil 2C) ve hücresel çekiş alanına (Şekil 1D ve Şekil 2D) göre YAP nükleer/sitoplazma (N/C) oranının nicel analizi için Fiji ImageJ, MATLAB ve Origin’i birleştirir. ). Sonuçlar, (1) fizyolojik olarak ilgili mekanik sertliğe sahip substratlara yayılan hücrenin ilk 10 h’si sırasında13,14,15,16,17,18, tek B2B hücrelerin YAP N/C oranının tek PC9 hücrelerine kıyasla daha belirgin zamana bağlı değişim ve dalgalanma gösterdiğini göstermektedir (Şekil 5 ve Şekil 6 ); ve (2) PC9 kanser hücreleri peri-nükleer bölgelerinde gözle görülür bir çekiş oluşturur (Şekil 7). Bu protokolde açıklanan entegre sistem ve metodolojiler, belirli hücre türlerini ve optogenetik molekülleri aşmaktadır. Araştırmacılar, özel canlı hücre sorgulama deneylerini özelleştirmek ve hücre fizyolojisi ve patolojisi bağlamında çok yönlü sinyal dinamiklerini aydınlatmak için protokolleri uygulayabilirler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Görüntüleme işlemi (adım 6.3), floresan görüntülerin geçerli nicelik sonuçları verecek kadar kaliteli olmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Floresan protein veya boncukların z-stack görüntüleri, numunenin yayıldığı tüm Z konumları için odak içi görüntüleri içerecek kadar büyük bir z aralığına sahip olmalıdır. Bir diğer kritik adım, hücreleri çözdükten sonra floresan boncukların referans görüntülerini toplamaktır (adım 6.5). 6.3. adımda referans görüntülerinin aynı pozisyonlarda alınması gerektiğinden, Petri kabı, çevre odası ve mikroskop arasında göreceli bir yer değiştirme indüklenmemelidir. Çözünme adımını gerçekleştiren araştırmacılar, Petri kabının kapağını çıkarmaya ve uygulanan mekanik pertürbasyonun kabın çevre odasındaki yerini değiştirecek kadar büyük olmadığından emin olmaya dikkat etmelidir.
Denemeler sırasında oluşabilecek bazı hataları gidermek için çözümler aşağıda verilmiştir. 6.4 adımında Enter’u tıklattıktan sonra hiçbir makro etkinleştirilmezse, bunun nedeni büyük olasılıkla ekranın sol alt alanının Öğe olmayan bir pencere tarafından işgal edilmiş olmasıdır. Böyle bir durumda, makroların Öğeler’de etkinleştirilebilmesi için pencerenin sol alt alanının temizlenmesi gerekir. Bir başka yaygın hata, parlak alan görüntülerinin siyah görünmesidir. Bu sorun, floresan ve parlak alan görüntülerinin edinimi arasındaki yetersiz zaman aralığından kaynaklanır. Floresan görüntüleme süresi sayımındaki hafif gecikmeler zamanla birikebilir ve önemli gecikmelere neden olabilir ve parlak alan görüntülemesini engelleyebilir. Bir çözüm, tüm pozisyonların bir görüntüleme döngüsünün süresini, ardışık hareketlerin başlangıcı arasındaki zaman aralığından daha az (eşit olmayacak) olacak şekilde ayarlamaktır. Bu işlem zaman sayımını yeniler ve her görüntüleme döngüsünün başındaki kümülatif hatayı ortadan kaldırır.
Bu tamamen optik sorgulama teknolojisi (1) Nikon dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çok çeşitli donanım/yazılımları, (2) jelatin, PEG, Matrigel ve kollajen I jelleri de dahil olmak üzere çeşitli doğrulanmış hidrojel sistemleri ve (3) araştırmacıların farklı ihtiyaçlarına dayalı programlanabilir özelleştirmeyi destekler. Ancak, alt düzey kontrol işlevlerinden herhangi biri ticari bir mikroskoptan kullanılamıyorsa, AMFIP kullanılarak işlevlerin özelleştirilmesi zorlaşır. Bu tekniğin bir diğer sınırlaması, numunenin hem XY hem de odak (Z) düzlemlerinde uzamsal sürüklenmesidir. Bu sınırlama görüntülerin işlenmesinden sonra aşılabilir, ancak örneklerin gerçek zamanlı sürüklenmesini düzeltmek için otomatik odaklama işlevini geliştirmek önemlidir. Bu iyileştirme, görüntüleme işleminin verimini artıracak ve deneyler sırasında sürüklenmenin neden olduğu olası hatayı azaltacaktır.
YAP gibi mekanotransdükerler, umut verici kanser tedavilerinin geliştirilmesi için yeni terapötik hedefler olarak hizmet edebilir25,26,27. Ortaya çıkan veriler, YAP’ın kanser hücrelerinin çoğalmasını ve istilasını desteklediğini göstermektedir. Sitoplazmadan çekirdeğe mekanik kaynaklı YAP translokasyonu hücre göçü, çoğalma, istila ve apoptoz ile ilgili genlerin transkripsiyonunu aktive ederek anormal hücre davranışlarına yol açar28,29,30,31. Bu çalışma, iki tipik insan akciğer kanseri ve normal hücre hattında YAP N/C oranı ve hücre mekaniğinin potansiyel korelasyonunu araştırmayı amaçlamaktadır. 10 saat hücre yayılma döneminde PC9 hücreleri çekirdek ve sitoplazmada benzer YAP konsantrasyonları gösterir (Şekil 3D ve Şekil 5A). B2B hücreleri çekirdekte sitoplazmadan daha yüksek yap konsantrasyonu gösterir (Şekil 3C ve Şekil 5A). Erken yayılma aşamasında bulunan bu ilişki, çekirdekteki YAP konsantrasyonunun normal ve kanser hücreleri arasında karşılaştırıldığı yayınlanan bulguların çoğundan farklıdır. Erken yayılma aşamasında olmasa da, yayınlanan bulguların çoğu YAP’ın normal hücrelerin çekirdeğine göre kanser hücrelerinin çekirdeğinde daha yoğun olduğunu göstermektedir27,28. Meme kanseri üzerine yapılan sadece bir çalışmada, YAP’ın sitoplazmda daha yoğun olduğunu gösteren bir istisna32 bildirilmiştir, bu da akciğer kanseri PC9 hücrelerinde yapılan mevcut gözlemlerimize uygundur. Yazarların bilgisine göre, bu çalışma bir insan akciğer kanseri hücre hattında daha düşük bir YAP N / C oranı gösteren ilk çalışmadır. Yazarlar, PC9 hücrelerinde stabil bir YAP N/C oranının nedeninin hücre/çekirdek yayılma alanındaki düşük varyasyondan ve erken yayılma aşamasında PC9 hücrelerindeki çekiş gücünden kaynaklanabileceğini vardır. PC9 ve B2B hücrelerde düşük YAP N/C oranının temel moleküler mekanizmalarının diseksiyonu devam etmektedir.
Yayılmanın ilk 10 saati boyunca, bu iki hücre çizgisi YAP YOK oranı, hücre çekişi ve yayılma alanı arasında belirgin bir ilişki gösterir (Şekil 5). B2B hücreleri için, daha yüksek bir YAP N/C oranı, diğer normal hücrelerin bildirilen verileriyle tutarlı olan daha yüksek bir hücre ve çekirdek yayılma alanı (Şekil 6A,B) ile ilişkilidir33. İlginçtir ki, bu ilişkinin gelişimsel eğilimi genellikle kaydedilen tüm B2B hücrelerinde bulunsa da, bu ilişkinin iki farklı derecesi (yüksek ve düşük) bulunur. Aynı anda yayılan ve göç eden B2B hücreler, daha yüksek YAP N/C oranına sahip daha düşük çekiş ve daha yüksek hücre ve çekirdek yayılma alanı gösterir (2,05 ± 0,32). Yayılan ve aynı yerde kalan B2B hücreleri için daha yüksek çekiş ve daha düşük yap N/C oranına sahip alt hücre ve çekirdek yayılma alanı gösterirler (1.74 ± 0.21). Bu iki derecelik ilişkiler, çatallanmış dağınık veri gruplarında gösterilmiştir (Şekil 6C,D). Literatürde bildirildiği gibi, embriyonik fibroblast NIH 3T3 hücreleri gibi sabit normal hücreler, göçmen hücrelerden daha yüksek çekiş gücüne sahiptir34. Bu makalede bildirilen veriler, yayılan ve göç etmeyen B2B hücrelerinin, B2B hücrelerinin yayılmasından ve taşınmasından daha yüksek çekiş uyguladığını, muhtemelen göç etmeyen hücrelerin substrat üzerinde stabilize olması için yüksek çekiş gerektiğini göstermektedir.
Ek olarak, bu veriler sabit normal B2B hücrelerinin daha yüksek bir peri-nükleer kuvvet ürettiğini gösterirken, diğer araştırmacılar tarafından yapılan önceki araştırmalar sabit hücrelerin çevresinde üretilen sadece daha yüksek hücre çekişi bildirdi34,35,36,37. Yazarlar, deneylerdeki içsel göç eğilimindeki farkın bu çelişkili sonuçlara neden olabileceğini düşünüyor. Yayınlanan deneylerde, tek hücrelerin yayılmasını sınırlamak ve göçü engellemek için kare şekilli mikropatterning kullanılmıştır; hücrelerin geçiş eğilimi olup olmadığı bilinmemektedir. Göçmen hücreler genellikle hücrelerin çevresinde yüksek çekiş kuvveti gösterdiğinden38, göç etme eğilimi olan hücrelerin göçleri kısıtlanmış olsa bile hala yüksek çevresel çekişi sürdürmeleri muhtemeldir. Bu çalışmada, sabit hücreler herhangi bir mikropattern tarafından kısıtlanmamaktadır, ancak hücrelerin göç etmeyen durumlarını koruma eğiliminde olduklarını gösteren göç etmezler. Diğer bir olasılık, mikropattern tarafından tanımlanan hücre şeklinin odak yapışıklıklarının ve çekiş kuvvetlerinin dağılımını etkileyebileceğidir39. Bu çalışmadaki sonuçlar herhangi bir mikropatterning olmadan oluşturulmuş ve sabit hücrelerin orijinal şekillerindeki kuvvet dağılımını temsil eder.
Yazarların bilgisine göre, bugüne kadar sadece bir yayın, çekirdek40’a yayılan akrin kapağının neden olabileceği normal hücrelerde (fare embriyonik fibroblastları) peri-nükleer kuvvetlerin bulunmasını özellikle bildirdi. YAP sitoplazma-çekirdek translokasyonu peri-nükleer kuvvet40’taki artışla ilişkilidir. İlgili literatürün kapsamlı bir araştırması, peri-nükleer kuvveti veya kanser hücrelerindeki akran kapağını bildiren herhangi bir yayın vermedi. Melanom kanser hücreleri üzerinde yapılan dolaylı bir çalışma, aktin jantının (etrafında bulunan ancak çekirdeği kapsamayan başka bir peri-nükleer aktin organizasyonu) hücre göç oranlarını düşürdüğünü göstermiştir41, dolaylı olarak bir peri-nükleer kuvvetin varlığını düşündürmektedir. Ancak, doğrudan deneysel veri bildirilmemektedir. Bu çalışmada, yazarlar hem PC9 hem de B2B hücrelerinin peri-nükleer yer değiştirme ve çekiş gösterdiğini buldular. Peri-nükleer kuvvetlerin üretim mekanizmaları ve etkileri tartışmalı olmaya devam ediyor. Normal hücrelerde, aktin kapağının çekirdek morfolojisi ve kromatin organizasyonunun düzenlenmesinde rol oynadığı bildirilmiştir42, odak yapışıklıklarından mekanik sinyallerin nükleoskeleton ve sitoskeleton (LINC) kompleksinin bağlayıcıları aracılığıyla çekirdeğe iletilmesi43 ve hücre göçlerinin düzenlenmesi44. Lamin Klima, akin kapağının oluşumu ve bozulması ile ilgilidir40,41,42,43,44. Bununla birlikte, aktiin kapağının peri-nükleer bir güç ürettiğini iddia eden rapor, actin rim40’ın potansiyel rolünü dikkate almadı. Kanser hücrelerinde, Lamin A’nın aşırı ifade etmesi bir akin jantı oluşumunu kolaylaştırır ve kanser hücresi göçini kısıtlar. Lamin B’nin aşırı ifade etmesi akredin jant oluşumunu azaltır ve göçü teşvik eder. Peri-nükleer aktivin örgütünün varlığı ve Lamin A’nın etkisiyle peri-nükleer gücü bu sürece dahil olabilir. Bununla birlikte, bu çalışmanın sonuçları, ölçülen peri-nükleer kuvvetlere veya akin kapağının davranışına dair herhangi bir kanıt göstermedi. Bu nedenle, bu çalışmada PC9 hücrelerinde peri-nükleer kuvvetlerin keşfi, akciğer kanseri hücrelerindeki peri-nükleer kuvvetleri ve yer değiştirmeleri gösteren ilk rapordur. Yazarlar şu anda CRISPR/Cas9 tarafından tasarlanmış PC9 ve B2B hücrelerinde peri-nükleer kuvvetlerin moleküler mekanizmalarını ve işlevlerini araştırmamaktadır.
Bu makalede gösterilen tüm optik mekanobiyoloji sorgulamasının ötesinde, entegre çok fonksiyonlu sistem, canlı sistemlerdeki sayısız diğer temel fizyolojik ve patobiyolojik sinyalleri optik olarak araştırmak için uygulanabilir. Örneğin, yazarların laboratuvarı son zamanlarda üç ışık duyarlı membran proteinini birlikte ifade eden birden fazla saptan transdüklenmiş insan kanseri hücre hattı kurdu: membran voltaj göstergesi QuasAr2 (heyecan: 640 nm; emisyon: 660 nm-740 nm), membran voltaj depolarizörü CheRiff (heyecan: 488 nm) ve membran voltajı hiperpolarizatör eNpHR3 (heyecan: 590 nm). Bu üç fonksiyonel protein spektrum-ortogonal lazer hatları ile çapraz konuşma içermeyen bir şekilde aktive edilebilir ve membran elektrofizyolojisinin tüm optik iki yönlü sinyal iletişimini (okuma ve kontrol) sağlar. Entegre bir opto-elektronik sistemi ve manuel bir yama kelepçesi kullanan yazarlar, tek insan kanser hücrelerinde ve çok hücreli tümör sferoidlerinde membran voltajının (Vm) tüm optik kontrolünü ve okunmasını doğruladılar. Tüm optik elektrofizyoloji sorgulaması, kanser hücrelerinde daha önce erişilemeyen biyoelektrikliğin ayrıntılı olarak araştırılması olasılığını açar ve bu da tümör biyolojisini yeni bir eksenden ilerletmeye yardımcı olabilir.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje, UF Sağlık Kanseri Merkezi’nden (X. T. ve D. S.) Kanser Pilot Ödülü ve Gatorade Ödülü Başlangıç Paketi (X. T.) tarafından finansal olarak desteklenmektedir. Yazarlar, Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Ji-Hyun Lee (Biyoistatistik, UF), Dr. Hugh Fan (MAE, UF), Dr. Warren Dixon (MAE, UF), Dr. Ghatu Subhash (MAE, UF), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE, UF), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE, UF), Dr. Scott Banks (MAE, UF), Dr. Matthew Traum (MAE, UF), Dr. David Hahn (Arizona Üniversitesi), Dr. Weihong Wang (Oracle Corporation), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Politeknik Üniversitesi) ve Nikon Destek Ekibi (Dr. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon ve Jon Ekman). Yazarlar, Tang’s, Siemann’s ve Guan’ın araştırma laboratuvarlarının tüm üyelerinden ve MAE & ECE & Fizik ve Radyasyon Onkolojisi Departmanları, UF’nin tüm personelinden gelen cömert ve etkili destek için derinden minnettardır.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-aldrich | 440140 | |
| 0.05 % Trypsin | Corning | 25-051-CI | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| 8 Benchtop Centrifuge | Thermo | 75007210 | |
| A1R confocal system | Nikon | HD25 | |
| Acetic acid | Sigma-aldrich | 695092 | glacial, ACS reagent, ≥99.7% |
| BEAS-2B (B2B) cells | Sigma-aldrich | 95102433 | human epithelial cells from lung tissue |
| Carboxylate-Modified Microspheres | Invitrogen | F8797 | |
| Culture medium (RPMI-1640) | Gibco | 11875093 | |
| Desktop Computer | Dell | 2018 | with Windows 10 operating system |
| Environmental chamber TIZB | Tokai Hit | TIZB | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fiji ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | 1.53k | |
| Glass-bottom petri dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| HEPES buffered saline | Sigma-aldrich | 51558 | |
| Hydrazine hydrate solution | Sigma-aldrich | 53847 | |
| IntelliJ IDEA | JetBrains | 2020 | Java development platform |
| Java Development Kit | Oracle | 14.0 | |
| Kimwipe | Kimtech Science | 3066-05 | |
| MATLAB | MathWorks | 2020b | |
| Monochrome Camera | FLIR | BFS-U3-70S7M-C | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-218 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide solution | Sigma-aldrich | M1533 | |
| NIS-Elements software platform | Nikon | 4.50 | software platform |
| Origin | OriginLab | OriginPro 2017 (Learning Edition) | data analysis and graphing software |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PC9 cells | Sigma-aldrich | 90071810 | human adenocarcinoma cells from lung tissue |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-553S | high-fidelity DNA polymerase |
| Scotch tape | Scotch | adhesive tape | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma-aldrich | 05030 | |
| Super glue | Gorilla | cyanoacrylate glue | |
| Ti2-E inverted microscope | Nikon | MEA54000 | |
| TI2-S-SE-E Motorized Stage with Encoder | Nikon | MEC56120 | |
| μManager | version 2.0 gamma | open source microscopy software (https://micro-manager.org/) |
Riferimenti
- Werley, C., Boccardo, S., Rigamonti, A., Hansson, E., Cohen, A. Multiplexed optical sensors in arrayed islands of cells for multimodal recordings of cellular physiology. Nature Communications. 11 (1), 3881 (2020).
- Yang, B., et al. Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution. Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).
- Saraswathibhatla, A., Galles, E. E., Notbohm, J. Spatiotemporal force and motion in collective cell migration. Scientific Data. 7 (1), 197 (2020).
- Saraswathibhatla, A., Henkes, S., Galles, E. E., Sknepnek, R., Notbohm, J. Coordinated tractions control the size of a collectively moving pack in a cell monolayer. Extreme Mechanics Letters. 48, 101438 (2021).
- Wang, W., Kim, C. K., Ting, A. Y. Molecular tools for imaging and recording neuronal activity. Nature Chemical Biology. 15 (2), 101-110 (2019).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
- Carpenter, A. E., Kamentsky, L., Eliceiri, K. W. A call for bioimaging software usability. Nature Methods. 9 (7), 666-670 (2012).
- Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Luo, Q., et al. Automatic multi-functional integration program (AMFIP) towards all-optical mechanobiology interrogation. bioRxiv. , (2021).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using manager. Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).
- Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
- Tang, X., Tofangchi, A., Anand, S. V., Saif, T. A. A novel cell traction force microscopy to study multi-cellular system. PLOS Computational Biology. 10 (6), 1003631 (2014).
- Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
- Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).
- Phelps, E. A., et al. Maleimide cross-linked bioactive PEG hydrogel exhibits improved reaction kinetics and cross-linking for cell encapsulation and in situ delivery. Advanced Materials. 24 (1), 64-70 (2012).
- Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 95 (4), 1261-1269 (2010).
- Temples, M. N., Adjei, I. M., Nimocks, P. M., Djeu, J., Sharma, B. Engineered three-dimensional tumor models to study natural killer cell suppression. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (7), 4179-4199 (2020).
- Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370 (2017).
- Guan, J., Liu, H., Shi, X., Feng, S., Huang, B. Tracking multiple genomic elements using correlative CRISPR imaging and sequential DNA FISH. Biophysical Journal. 112 (6), 1077-1084 (2017).
- . Micro-Manager Available from: https://micro-manager.org/wiki/NikonTi2 (2021)
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Martiel, J. L., et al. Measurement of cell traction forces with ImageJ. Methods in Cell Biology. 125, 269-287 (2015).
- Okumurai, I. A. On the generalization of Cerruti’s problem in an elastic half-space. Doboku Gakkai Ronbunshu. 1995, 1-10 (1995).
- Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
- Hong, W. W., Guan, K. L. The YAP and TAZ transcription co-activators: Key downstream effectors of the mammalian Hippo pathway. Seminars in Cell and Developmental Biology. 23 (7), 785-793 (2012).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the roots of cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
- Wang, Y., et al. Overexpression of yes-associated protein contributes to progression and poor prognosis of non-small-cell lung cancer. Cancer Science. 101 (5), 1279-1285 (2010).
- Li, H., et al. Inhibition of YAP suppresses CML cell proliferation and enhances efficacy of imatinib in vitro and in vivo. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 35 (1), 134 (2016).
- Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13, 131 (2014).
- Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 758-770 (2017).
- Yuan, M., et al. Yes-associated protein (YAP) functions as a tumor suppressor in breast. Cell Death and Differentiation. 15 (11), 1752-1759 (2008).
- Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. bioRxiv. , (2020).
- Chang, S. S., Rape, A. D., Wong, S. A., Guo, W. H., Wang, Y. L. Migration regulates cellular mechanical states. Molecular Biology of the Cell. 30 (26), 3104-3111 (2019).
- Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
- Lee, J., Abdeen, A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
- Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Rape, A., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).
- Shiu, J. Y., Aires, L., Lin, Z., Vogel, V. Nanopillar force measurements reveal actin-cap-mediated YAP mechanotransduction. Nature Cell Biology. 20 (3), 262-271 (2018).
- Fracchia, A., Asraf, T., Salmon-Divon, M., Gerlitz, G. Increased lamin B1 levels promote cell migration by altering perinuclear actin organization. Cells. 9 (10), 2161 (2020).
- Ramdas, N. M., Shivashankar, G. V. Cytoskeletal control of nuclear morphology and chromatin o1rganization. Journal of Molecular Biology. 427 (3), 695-706 (2015).
- Khatau, S. B., et al. A perinuclear actin cap regulates nuclear shape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19017-19022 (2009).
- Kim, D. H., Cho, S., Wirtz, D. Tight coupling between nucleus and cell migration through the perinuclear actin cap. Journal of Cell Science. 127 (11), 2528-2541 (2014).
