قياس امتصاص الجلوكوز في نماذج Drosophila من اعتلال البروتين TDP-43
Summary
يتم زيادة امتصاص الجلوكوز في الخلايا العصبية الحركية Drosophila المتضررة من بروتين تار ملزمة الحمض النووي (TDP-43) اعتلال البروتين، كما هو مبين من قبل FRET القائم، ومستشعر الجلوكوز المشفرة وراثيا.
Abstract
التصلب الجانبي الضموري هو اضطراب تنكسي عصبي يسبب ضعف العضلات التدريجي والموت في غضون 2-5 سنوات بعد التشخيص. المظاهر السريرية تشمل فقدان الوزن, ديسليبيديميا, وفرط الأيض; ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح كيف ترتبط هذه إلى انحطاط الخلايا العصبية الحركية. باستخدام نموذج Drosophila من اعتلال البروتين TDP-43 الذي يلخص العديد من ميزات ALS بما في ذلك إدراج السيتوبلازمي ، والخلل الحركي ، وانخفاض العمر ، حددنا مؤخرا عجزا استقلابيا واسع النطاق. ومن بين هذه العوامل، تبين أن التحليل الجليكولي منظم وأن تجارب التفاعل الجيني قدمت أدلة على وجود آلية تعويضية لاعصاب. في الواقع ، على الرغم من تنظيم فوسبهوفروكتوكيناز ، وهو معدل يحد من الإنزيم في انحلال الجليكوليسيس ، فقد ثبت أن زيادة في تحليل الجليكوليسيس باستخدام التلاعب الغذائي والجيني تخفف من الخلل الحركي وزيادة العمر الافتراضي في نماذج ذبابة اعتلال البروتين TDP-43. لمزيد من التحقيق في تأثير على اعتلال البروتين TDP-43 على تدفق الجليكوليك في الخلايا العصبية الحركية، تم استخدام جهاز استشعار مشفر وراثيا، FRET المستندة إلى، FLII12Pglu-700μδ6. يتكون هذا المستشعر من مجال استشعار الجلوكوز البكتيري والبروتينات الفلورية السماوي والأصفر كزوج FRET. عند ربط الجلوكوز ، يخضع المستشعر لتغيير تشكيلي يسمح بحدوث FRET. باستخدام FLII12Pglu-700μδ6، تم العثور على امتصاص الجلوكوز أن تكون زيادة كبيرة في الخلايا العصبية الحركية التي تعبر عن TDP-43G298S،وهو البديل المسببة ALS. هنا، نعرض كيفية قياس امتصاص الجلوكوز، ex vivo، في مستحضرات الحبل العصبي البطني اليرقات التي تعبر عن مستشعر الجلوكوز FLII12Pglu-700μδ6 في سياق اعتلال البروتين TDP-43. يمكن استخدام هذا النهج لقياس امتصاص الجلوكوز وتقييم التدفق الجليكوليكي في أنواع مختلفة من الخلايا أو في سياق الطفرات المختلفة التي تسبب المرض والاضطرابات العصبية التنكسية ذات الصلة.
Introduction
التصلب الجانبي الضموري (ALS) هو اضطراب تنكسي عصبي تدريجي غير قابل للشفاء حاليا. ALS يؤثر على الخلايا العصبية الحركية العلوية والسفلية مما يؤدي إلى فقدان التنسيق الحركي, الشلل الذي لا رجعة فيه, فشل الجهاز التنفسي, والموت في نهاية المطاف في غضون 2-5 سنوات من التشخيص1. ويرتبط ALS مع العيوب الأيضية مثل فقدان الوزن, ديسليبيديميا, وفرط الأيض (استعرضت في2); ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح كيف ترتبط هذه التعديلات في التمثيل الغذائي إلى انحطاط الخلايا العصبية الحركية. القاسم المشترك في ALS والأمراض العصبية التنكسية ذات الصلة هو TDP-43 ، وهو بروتين ملزم حمض النوى تشارك في عدة خطوات من تجهيز الحمض النووي الريبي3،4،5. على الرغم من أن الطفرات في TDP-43 تؤثر فقط على 3٪ -5٪ من المرضى، تم العثور على بروتين TDP-43 البري من النوع داخل المجاميع السيتوبلازمية في >97٪ من حالات ALS (تمت مراجعتها في6). وقد تم تصميم هذا المرض في Drosophila عن طريق الإفراط في التعبير عن النمط البري البشري أو TDP-43 المتحولة (G298S) في الخلايا العصبية الحركية ، والتي تلخص جوانب متعددة من ALS ، بما في ذلك التضمين السيتوبلازمي ، والخلل الحركي وانخفاض عمر7،8. باستخدام هذه النماذج, أفيد مؤخرا أن اعتلال البروتين TDP-43 يسبب زيادة كبيرة في مستويات بيروفات وفوسففروكوكيناز (PFK) مرنا, معدل الحد من انزيم تحلل9. تم العثور على زيادات مماثلة في نصوص PFK في الخلايا العصبية الحركية المشتقة من المريض والحبل الشوكي ، مما يشير إلى أن انحلال الجليكوليسيس يتم تنظيمه في سياق اعتلال البروتين TDP-43. ومن المثير للاهتمام أن زيادة أخرى في تحليل الجليكوليسيس باستخدام التلاعبات الغذائية والجينية خففت من العديد من الأنماط الظاهرية ل ALS مثل الخلل الحركي وزيادة العمر الافتراضي في نماذج ذبابة اعتلال البروتين TDP-43 ، بما يتفق مع آلية تعويضية واعصاب في تتدهور الخلايا العصبية الحركية.
لمزيد من التغييرات التحقيق في انحلال الجليكوليسيس وقياس امتصاص الجلوكوز في نماذج Drosophila من اعتلال البروتين TDP-43، تم التعبير عن جهاز استشعار مشفرة وراثيا سابقا FRET المستندة FLII12Pglu-700μδ610 في الخلايا العصبية الحركية على وجه التحديد باستخدام نظام التعبير UAS-GAL4. يستخدم مستشعر الجلوكوز FLII12Pglu-700μδ6 نقل الطاقة بالرنين بين متغيرين من البروتين الفلوري الأخضر، بروتينات الفلورسنت السماوي والأصفر (CFP و YFP) للكشف عن الجلوكوز على المستوى الخلوي. وهو يتألف من مجال ملزم الجلوكوز البكتيرية من الجين E. coli MglB تنصهر على CFP وYFP على طرفي نقيض من الجزيء. عندما ملزمة جزيء الجلوكوز، وأجهزة الاستشعار يخضع لتغيير تشكيلي جلب CFP وYFP أقرب معا والسماح FRET أن يحدث، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتحديد مستويات الجلوكوز داخل الخلايا10،11،12 ( الشكل1). هنا، نعرض كيف يمكن استخدام مستشعر FLII12Pglu-700μδ6 لتحديد التغيرات في امتصاص الجلوكوز الناجمة عن اعتلال البروتين TDP-43 في الخلايا العصبية الحركية. التجارب الموصوفة هنا تبين أن الإفراط في التعبير عن متحولة المرتبطة ALS, TDP-43G298S, في الخلايا العصبية الحركية يسبب زيادة كبيرة في امتصاص الجلوكوز بالمقارنة مع الضوابط. ويمكن استخدام هذا النهج في أنواع أخرى من ALS (مثل، SOD1، C9orf72، الخ) و / أو أنواع الخلايا الأخرى (مثل غليا، العضلات) لتحديد التغيرات في امتصاص الجلوكوز المرتبطة بالتنكس العصبي.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويمكن تطبيق هذه التقنية الموضحة بالتفصيل هنا لقياس امتصاص الجلوكوز في نوع معين من الخلايا من الاهتمام في Drosophila الحية باستخدام FLII12Pglu-700μδ6، وهو جهاز استشعار FRET القائم الذي يمكن الكشف عن التغيرات في مستويات الجلوكوز إلى نطاق ميليمولار10،11،<sup class="xre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ستيفاني شيرماير و تاكيشي إيواتسوبو على توفير سلالات دروسوفيلا. كما نشكر باتريشيا جانسما على مساعدتها في التصوير في مارلي إيماج كور في جامعة أريزونا. تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة NIH NS091299، NS115514 (إلى DCZ)، زمالة HHMI جيليام (إلى EM) وبرنامج أبحاث البيولوجيا الجامعية (إلى HB).
Materials
| 35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
| 40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
| dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
| Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
| Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
| Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
| Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |
Riferimenti
- Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).
- Dupuis, L., Pradat, P. F., Ludolph, A. C., Loeffler, J. P. Energy metabolism in amyotrophic lateral sclerosis. The Lancet Neurology. 10 (1), 75-82 (2011).
- Buratti, E., Baralle, F. E. Characterization and functional implications of the RNA binding properties of nuclear factor TDP-43, a novel splicing regulator of CFTR exon 9. The Journal of Biological Chemistry. 276 (39), 36337-36343 (2001).
- Polymenidou, M., et al. Long pre-mRNA depletion and RNA missplicing contribute to neuronal vulnerability from loss of TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 459-468 (2011).
- Tollervey, J. R., et al. Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 452-458 (2011).
- Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
- Estes, P. S., et al. Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS. Human Molecular Genetics. 20 (12), 2308-2321 (2011).
- Estes, P. S., et al. Motor neurons and glia exhibit specific individualized responses to TDP-43 expression in a Drosophila model of amyotrophic lateral sclerosis. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 721-733 (2013).
- Manzo, E., et al. Glycolysis upregulation is neuroprotective as a compensatory mechanism in ALS. eLife. 8, 45114 (2019).
- Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106, 55-64 (2018).
- Fehr, M., Lalonde, S., Lager, I., Wolff, M. W., Frommer, W. B. In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19127-19133 (2003).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimedica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
- Ihara, R., et al. RNA binding mediates neurotoxicity in the transgenic Drosophila model of TDP-43 proteinopathy. Human Molecular Genetics. 22 (22), 4474-4484 (2013).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor. Journal of Neuroscience Research. 97 (8), 946-960 (2019).
- Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
- Lu, B., Vogel, H. Drosophila models of neurodegenerative diseases. Annual Review of Pathology. 4, 315-342 (2009).
