Glukoseoptagelse øges i Drosophila motoriske neuroner, der er påvirket af TAR DNA-bindende protein (TDP-43) proteinopati, som angivet af en FRET-baseret, genetisk kodet glukosesensor.
Amyotrofisk lateral sklerose er en neurodegenerativ lidelse, der forårsager progressiv muskelsvaghed og død inden for 2-5 år efter diagnosen. Kliniske manifestationer omfatter vægttab, dyslipidæmi, og hypermetaboli; Det er dog fortsat uklart, hvordan disse vedrører motor neuron degeneration. Ved hjælp af en Drosophila model af TDP-43 proteinopati, der opsummerer flere funktioner i ALS, herunder cytoplasmaiske indeslutninger, lokomotorisk dysfunktion, og reduceret levetid, vi for nylig identificeret vidtrækkende metaboliske underskud. Blandt disse, glykolyse blev anset for at være opreguleret og genetisk interaktion eksperimenter forudsat dokumentation for en kompenserende neuroprotektive mekanisme. På trods af upregulation af phosphofructokinase, den satsbegrænsende enzym i glykolyse, viste en stigning i glykolyse ved hjælp af kost- og genetiske manipulationer sig at afbøde lokomotorisk dysfunktion og øget levetid i flyvemodeller af TDP-43 proteinopati. For yderligere at undersøge effekten på TDP-43 proteinopati på glykolytisk flux i motoriske neuroner, en tidligere rapporteret genetisk kodet, FRET-baserede sensor, FLII12Pglu-700μδ6, blev brugt. Denne sensor består af en bakteriel glukose-sensing domæne og cyan og gul fluorescerende proteiner som FRET par. Ved glukosebinding gennemgår sensoren en kropsbygningsændring, der gør det muligt for FRET at forekomme. Ved hjælp af FLII12Pglu-700μδ6, glukose optagelse viste sig at være signifikant øget i motoriske neuroner udtrykker TDP-43G298S, en ALS forårsager variant. Her viser vi, hvordan man måler glukoseoptagelse, ex vivo, i larve ventrale nerveledningspræparater, der udtrykker glukosesensoren FLII12Pglu-700μδ6 i forbindelse med TDP-43 proteinopati. Denne tilgang kan bruges til at måle glukoseoptagelse og vurdere glykolytisk flux i forskellige celletyper eller i forbindelse med forskellige mutationer, der forårsager ALS og relaterede neurodegenerative lidelser.
Amyotrofisk Lateral Sklerose (ALS) er en progressiv neurodegenerativ lidelse, der i øjeblikket er uhelbredelig. ALS påvirker øvre og nedre motoriske neuroner, der fører til tab af motorisk koordination, irreversibel lammelse, respirationssvigt og eventuel død inden for 2-5 år efterdiagnosen 1. ALS er forbundet med metaboliske defekter såsom vægttab, dyslipidæmi og hypermetabolisme (gennemgået i2); Det er dog fortsat uklart, hvordan disse ændringer i stofskiftet vedrører motor neuron degeneration. En fællesnævner i ALS og relaterede neurodegenerative sygdomme er TDP-43, et nukleinsyrebindingsprotein, der er involveret i flere trin af RNA-behandling3,4,5. Selvom mutationer i TDP-43 kun påvirker 3%-5% af patienterne, findes vildt type TDP-43 protein inden for cytoplasmaiske aggregater i >97% af ALS-tilfælde (gennemgået i6). Denne patologi blev modelleret i Drosophila ved overekspression af human wildtype eller mutant TDP-43 (G298S) i motoriske neuroner, som opsummerer flere aspekter af ALS, herunder cytoplasmaiske indeslutninger, lokomotorisk dysfunktion og reduceret levetid7,8. Ved hjælp af disse modeller blev det for nylig rapporteret, at TDP-43 proteinopati forårsager en betydelig stigning i pyruvatniveauer og phosphofructokinase (PFK) mRNA, det satsbegrænsende enzym af glykolyse9. Lignende stigninger i PFK udskrifter blev fundet i patient-afledte motoriske neuroner og rygmarv, tyder på, at glykolyse er opreguleret i forbindelse med TDP-43 proteinopati. Interessant, yderligere stigning i glykolyse ved hjælp af kosten og genetiske manipulationer afbødes flere ALS fænotyper såsom lokomotorisk dysfunktion og øget levetid i flyve modeller af TDP-43 proteinopati, i overensstemmelse med en kompenserende, neuroprotektive mekanisme i degenererende motoriske neuroner.
For yderligere sondeændringer i glykolyse og måle glukoseoptagelse i Drosophila-modeller af TDP-43 proteinopati blev en tidligere rapporteret genetisk kodet FRET-baseret sensor FLII12Pglu-700μδ610 udtrykt i motoriske neuroner specifikt ved hjælp af UAS-GAL4-ekspressionssystemet. FLII12Pglu-700μδ6 glukosesensoren bruger resonansenergioverførsel mellem to varianter af grønt fluorescerende protein, cyan og gule fluorescerende proteiner (CFP og YFP) til at detektere glukose på celleniveau. Den består af et bakteriel glukosebindingsdomæne fra E. coli MglB-genet, der er smeltet til cfp og YFP i modsatte ender af molekylet. Når sensoren bindes til et glukosemolekyle, gennemgår den en kropsbygningsændring, der bringer den fælles fiskeripolitik og YFP tættere sammen og gør det muligt for FRET at forekomme, som derefter kan bruges til at kvantificere intracellulære glukoseniveauer10,11,12 ( Figur1). Her viser vi, hvordan FLII12Pglu-700μδ6 sensoren kan bruges til at bestemme ændringer i glukoseoptagelse forårsaget af TDP-43 proteinopati i motoriske neuroner. De eksperimenter, der er beskrevet her, viser, at overekspression af en ALS-associeret mutant, TDP-43G298S, i motoriske neuroner forårsager en betydelig stigning i glukoseoptagelse sammenlignet med kontroller. Denne fremgangsmåde kan anvendes i andre typer als (f.eks. SOD1, C9orf72 osv.) og/eller andre celletyper (f.eks. glia, muskler) til at bestemme ændringer i glukoseoptagelse forbundet med neurodegeneration.
Den teknik, der er beskrevet i detaljer her, kan anvendes til at måle glukoseoptagelse i en bestemt celletype af interesse for levende Drosophila ved hjælp af FLII12Pglu-700μδ6, en FRET-baseret sensor, der kan registrere ændringer i glukoseniveauer til et millimolarområde10,11,12. Denne sensor er tidligere blevet brugt sammen med UAS-GAL4-systemet til at målrette sit udtryk mod bestemte celletyper, herunder neuro…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Stefanie Schirmeier og Takeshi Iwatsubo for at give Drosophila stammer. Vi takker også Patricia Jansma for at hjælpe med billeddannelse i Marley Imaging Core på University of Arizona. Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health NIH NS091299, NS115514 (til DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (til EM) og Undergraduate Biology Research Program (til HB).
35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |