Glukoseopptaket økes i Drosophila motoriske nevroner påvirket av TAR DNA-bindende protein (TDP-43) proteinopati, som indikert av en FRET-basert, genetisk kodet glukosesensor.
Amyotrofisk lateral sklerose er en nevrodegenerativ lidelse som forårsaker progressiv muskelsvakhet og død innen 2-5 år etter diagnosen. Kliniske manifestasjoner inkluderer vekttap, dyslipidemi og hypermetabolisme; Det er imidlertid fortsatt uklart hvordan disse forholder seg til motorisk nevron degenerasjon. Ved hjelp av en Drosophila-modell av TDP-43-proteinopati som rekapitulerer flere funksjoner i ALS, inkludert cytoplasmatiske inneslutninger, lokomotorisk dysfunksjon og redusert levetid, identifiserte vi nylig brede metabolske underskudd. Blant disse ble glykolyse funnet å være oppregulert og genetiske interaksjonseksperimenter ga bevis for en kompenserende nevrobeskyttende mekanisme. Faktisk, til tross for oppregulering av fosfofructokinase, hastigheten begrensende enzym i glykolyse, en økning i glykolyse ved hjelp av kosthold og genetiske manipulasjoner ble vist å redusere lokomotorisk dysfunksjon og økt levetid i fly modeller av TDP-43 proteinopati. For å undersøke effekten på TDP-43 proteinopati på glykolytisk flux i motoriske nevroner, ble en tidligere rapportert genetisk kodet, FRET-basert sensor, FLII12Pglu-700μδ6, brukt. Denne sensoren består av et bakteriell glukosesensordomene og cyan og gule fluorescerende proteiner som FRET-paret. Ved glukosebinding gjennomgår sensoren en konformasjonsendring som gjør at FRET kan forekomme. Ved hjelp av FLII12Pglu-700μδ6 ble glukoseopptak funnet å være betydelig økt i motoriske nevroner som uttrykker TDP-43G298S, en ALS forårsaker variant. Her viser vi hvordan du måler glukoseopptak, ex vivo, i larval ventrale nerveledningspreparater som uttrykker glukosesensoren FLII12Pglu-700μδ6 i sammenheng med TDP-43 proteinopati. Denne tilnærmingen kan brukes til å måle glukoseopptak og vurdere glykolytisk flux i forskjellige celletyper eller i sammenheng med ulike mutasjoner som forårsaker ALS og relaterte nevrodegenerative lidelser.
Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) er en progressiv nevrodegenerativ lidelse som for tiden er uhelbredelig. ALS påvirker øvre og nedre motoriske nevroner som fører til tap av motorisk koordinering, irreversibel lammelse, åndedrettssvikt og eventuell død innen 2-5 års diagnose1. ALS er forbundet med metabolske defekter som vekttap, dyslipidemi og hypermetabolisme (gjennomgått i2); Det er imidlertid fortsatt uklart hvordan disse endringene i metabolismen forholder seg til motorisk nevron degenerasjon. En fellesnevner i ALS og relaterte nevrodegenerative sykdommer er TDP-43, et nukleinsyrebindende protein involvert i flere trinn i RNA-behandling3,4,5. Selv om mutasjoner i TDP-43 bare påvirker 3% -5% av pasientene, finnes wild-type TDP-43 protein i cytoplasmatiske aggregater i >97% av ALS-tilfeller (gjennomgått i6). Denne patologien ble modellert i Drosophila ved overekspression av menneskelig wildtype eller mutant TDP-43 (G298S) i motoriske nevroner, som recapitulates flere aspekter av ALS, inkludert cytoplasmatiske inneslutninger, lokomotorisk dysfunksjon og redusert levetid7,8. Ved hjelp av disse modellene ble det nylig rapportert at TDP-43 proteinopati forårsaker en betydelig økning i pyruvatnivåer og fosfofructokinase (PFK) mRNA, den hastighetsbegrensende enzymet av glykolyse9. Lignende økninger i PFK-transkripsjoner ble funnet i pasientavledede motoriske nevroner og ryggmarger, noe som tyder på at glykolyse er oppregulert i sammenheng med TDP-43 proteinopati. Interessant nok reduserte ytterligere økning i glykolyse ved hjelp av kostholds- og genetiske manipulasjoner flere ALS-fenotyper som lokomotorisk dysfunksjon og økt levetid i flymodeller av TDP-43 proteinopati, i samsvar med en kompenserende, nevrobeskyttende mekanisme for degenerering av motoriske nevroner.
For ytterligere sondeendringer i glykolyse og måle glukoseopptak i Drosophila-modeller av TDP-43-proteinopati, ble en tidligere rapportert genetisk kodet FRET-basert sensor FLII12Pglu-700μδ610 uttrykt i motoriske nevroner spesielt ved hjelp av UAS-GAL4-uttrykkssystemet. FLII12Pglu-700μδ6 glukosesensor bruker resonansenergioverføring mellom to varianter av grønt fluorescerende protein, cyan og gule fluorescerende proteiner (CFP og YFP) for å oppdage glukose på cellenivå. Den består av et bakteriell glukosebindingsdomene fra E. coli MglB-genet smeltet sammen til CFP og YFP i motsatte ender av molekylet. Når sensoren er bundet til et glukosemolekyl, gjennomgår den en konformasjonsendring som bringer CFP og YFP nærmere hverandre og lar FRET forekomme, som deretter kan brukes til å kvantifisere intracellulære glukosenivåer10,11,12 ( figur1). Her viser vi hvordan FLII12Pglu-700μδ6-sensoren kan brukes til å bestemme endringer i glukoseopptak forårsaket av TDP-43 proteinopati i motoriske nevroner. Forsøkene beskrevet her viser at overekspressering av et ALS-assosiert mutant, TDP-43G298S, i motoriske nevroner forårsaker en betydelig økning i glukoseopptak sammenlignet med kontroller. Denne tilnærmingen kan brukes i andre typer ALS (f.eks. SOD1, C9orf72, etc.) og/eller andre celletyper (f.eks. glia, muskler) for å bestemme endringer i glukoseopptaket forbundet med nevrodegenerasjon.
Teknikken beskrevet i detalj her kan brukes til å måle glukoseopptak i en bestemt celletype av interesse for levende Drosophila ved hjelp av FLII12Pglu-700μδ6, en FRET-basert sensor som kan oppdage endringer i glukosenivåer til et millimolarområde10,11,12. Denne sensoren har tidligere blitt brukt sammen med UAS-GAL4-systemet for å målrette uttrykket mot bestemte celletyper, inkludert nevroner9<…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Stefanie Schirmeier og Takeshi Iwatsubo for å ha gitt Drosophila stammer. Vi takker også Patricia Jansma for å ha bistått med bildebehandling i Marley Imaging Core ved University of Arizona. Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health NIH NS091299, NS115514 (til DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (til EM) og Bachelor Biology Research Program (til HB).
35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |