Vild caenorhabditis nematoder är associerade med många mikrober, ofta i tarmlumen eller infekterar tarmarna. Detta protokoll beskriver en metod för att berika okulära mikrober kolonisera tarmarna, dra nytta av motståndet hos dauer nagelband.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) har visat sig vara en utmärkt modell för att studera värd-mikrobinteraktioner och mikrobiomet, särskilt i samband med tarmarna. Nyligen har ekologisk provtagning av vilda Caenorhabditis nematoder upptäckt en mängd associerade mikrober, inklusive bakterier, virus, svampar och mikrosporidia. Många av dessa mikrober har intressant kolonisering eller infektion fenotyper som motiverar ytterligare studier, men de är ofta okulturerbara. Detta protokoll presenterar en metod för att berika de önskade intestinala mikroberna i C. elegans och relaterade nematoder och minska förekomsten av de många förorenande mikrober som följer nagelbandet. Detta protokoll innebär att tvinga djur in i det dauer utvecklingsstadiet och använda en serie antibiotika- och tvättmedelstvättar för att avlägsna extern förorening. Eftersom dauer djur har fysiologiska förändringar som skyddar nematoder från hårda miljöförhållanden, kommer alla tarmmikrober att skyddas från dessa förhållanden. Men för att berikning ska fungera måste mikroben av intresse bibehållas när djur utvecklas till dauers. När djuren lämnar dauerstadiet sprids de enskilt till enskilda linjer. F1-populationer väljs sedan ut för önskade mikrober eller infektionsfenotyper och mot synlig kontaminering. Dessa metoder kommer att göra det möjligt för forskare att berika okulturerbara mikrober i tarmlumen, som utgör en del av det naturliga mikrobiomet av C. elegans och intracellulära tarmpatogener. Dessa mikrober kan sedan studeras för kolonisering eller infektion fenotyper och deras effekter på värden fitness.
Den genetiska modellorganismen C. elegans är ett utmärkt in vivo-system för att studera värdmikroberinteraktioner1,2. De har relativt enkel fysiologi jämfört med andra djur, men mycket av deras cellbiologi är i grunden lik däggdjur vilket gör dem till en bra modell för biologisk forskning1,3,4. Dessutom är de mikroskopiska, lätta att underhålla och förblir transparenta under hela sin korta livslängd. Dessa egenskaper möjliggör snabba studier av mekanismerna som styr värd-mikrob interaktioner och visualisering av in vivo infektion och kolonisering av genetiskt följsamma värdar5,6. Slutligen svarar C. elegans snabbt på bakteriella, svamp- och virusinfektioner, vilket gör dem till en utmärkt modell för att studera värdmikroberinteraktioner och tarmfloran7,8,9.
En ökning av provtagningen av vilda C. elegans och andra nematoder har möjliggjort forskning om ekologin hos frilevande nematoder och naturlig genetisk variation10,11. Samtidigt har provtagningen också ökat upptäckten av naturligt förekommande biologiska patogener och mikrober som interagerar med C. elegans12,13,14,15, vilket leder till inrättandet av många värdmikrobmodellsystem som studerar interaktioner med virus, bakterier, mikrosporidia, oomyceter eller svampar16,17,18,19,20 . Vanligtvis finns vild C. elegans i ruttande stjälkar och frukter, ofta i mer tempererade klimat, och mestadels är de självreproducerande21. När dessa prover förs in i labbet isoleras vilda nematoder till klonpopulationer, med en rad associerade mikrobiota. När man upptäcker nya mikrober av intresse för Caenorhabditis nematoder, djur ofta direkt screenas för infektion eller kolonisering genom mikroskopi med hjälp av lätt visualiserade fenotyper. Till exempel kan virusinfektion visualiseras som en upplösning av tarmstrukturer, och mikrosporidiska stadier kan ses inuti värdceller som sporer eller meronter14,22. När en mikrob av intresse upptäcks för framtida undersökning måste den separeras från de andra förorenande mikrober som finns i de vilda nematoderna så att den kan studeras isolerat. I många fall kan den mikrob av intresse inte odlas in vitro, vilket gör det viktigt att berika mikroben i värdnematoden.
Till exempel beskriver detta protokoll ett vilt isolat av C. tropicalis som innehåller en bakterie som koloniserar inom tarmlumen av nematoder, som följer tarmepitellancellerna på ett riktat sätt. Fenotypiskt växer bakterien vinkelrätt längs tarmlumens inre sidor, vilket ger den ett borstliknande utseende, visualiserat på ett standard Normarski-mikroskop i alla stadier av djuret, inklusive dauer-scenen. Nematod tillväxt medium (NGM) plattan där denna vilda C. tropicalis stam odlades innehöll synlig förorening med andra mikrober. Detta protokoll utvecklades för att minska ytterligare förorenande mikrobiell tillväxt på plattorna för att studera denna okända vidhäftande bakterie. Nematoderna tvingades in i dauerstadiet för att skydda bakterierna i lumen och rengjordes sedan med hjälp av en serie tvättar. Efteråt identifierades den okända bakteriella arten genom dissekering av tarmarna och PCR förstärkning av 16S ribosomal DNA för sekvensering.
Sammantaget kan detta protokoll potentiellt berika alla mikrober av intresse som är associerade med en vildfångad nematod. Efteråt kommer forskare att identifiera målmikroben, visualisera in vivo-infektion eller koloniseringsfenotyper via mikroskopi och studera effekter på värdkondition eller andra aspekter av värdmikroberinteraktioner. Isolering och undersökning av nya mikrobiella arter som interagerar med Caenorhabditis nematoder kan avslöja de genetiska mekanismerna för värdimmunitet och nya paradigm för värd-mikrobinteraktioner som är relevanta för mikrobiell patogenes och mikrobiomstudier.
Detta protokoll beskriver isolering och identifiering av mikrober från vild-isolerade Caenorhabditis nematoder med hjälp av en serie rengöring förfaranden. Många mikrober är associerade med vildisolerade nematoder, och några av dem har spännande fenotyper som kan användas för framtida studier i värdmikroberinteraktioner och medfödd immunitet. Många odlingsbara mikrobiom och patogena bakterier har isolerats från vilda Caenorhabditis nematoder med hjälp av standardtekniker för in vitro bakteriell tillväxt25,26. Men inte alla mikrober kan odlas in vitro, och det blir nödvändigt att berika dem i vilda nematoder. Vissa mikrober har ett resistent sporstadium, såsom mikrosporidia, och höga koncentrationer av SDS kan användas för att döda de flesta bakterier och svampar, vilket möjliggör specifik anrikning av sporer12. Detta protokoll presenterar en metod för att berika okulär intestinala mikrober som inte är resistenta mot SDS och antibiotikabehandling.
Tekniken som presenteras här drar nytta av den miljöbeständighet som ses hos dauer djur på grund av fysiologiska förändringar som förstärkning av nagelband, undertrycka faryngala pumpning och täcka munnen med en buccal plugg27. Ett kritiskt steg i detta protokoll är inkubation över natten med olika antibiotika och 0,25% SDS. Detta steg används för att döda alla externa mikrober samtidigt som interna mikrober lämnas intakta. Medan C. elegans dauers har visat sig överleva SDS koncentrationer så höga vid 10% för 30 min27, använder detta protokoll en måttlig men långvarig inkubation för att inte bara döda mikrober utan ytterligare utsätta bakterier för antibiotika. Dessutom kan en måttlig koncentration av SDS bidra till att dauers från andra Caenorhabditis arter överlever, eftersom exponering av C. tropicalis till 1% SDS över natten resulterade i döden av alla dauer djur. Om alla dauers dör, bör koncentrationen av SDS och/eller exponeringstiden för SDS minskas. Omvänt, om F1-generationens plattor fortfarande har synlig förorening efter rengöring, bör SDS-koncentrationen och inkubationstiden ökas.
Ett annat kritiskt steg är isoleringen av enskilda dauerdjur efter rengöring. Detta steg är avgörande eftersom inte alla djur är rena efter SDS och antibiotikabehandling. Därför placeras djuren i mitten av en 10 cm NGM-platta med OP50-1 och får krypa radiellt utåt. Ofta är det bäst att plocka fler distala djur, eftersom utökad krypning genom OP50-1 verkar hjälpa till att ta bort eventuella överlevande mikrober som är fästa vid nagelbandet. Detta leder dock till en begränsning av protokollet, eftersom det kommer att bli svårare att berika för en mikrob av intresse om det inte finns i befolkningen med hög frekvens. Här var den vidhäftande Alphaproteobacteria närvarande i 90%-95% av befolkningen; Därför hade de flesta rena plattor mikrobiomets bakterie. Men om en mikrob av intresse finns med en mycket lägre frekvens i befolkningen, kan det vara nödvändigt att screena många fler F1-plattor .
Detta protokoll kan sannolikt användas för att isolera ett antal icke-odlingsbara mikrober av intresse som finns i vilda nematoder. Mikroben skall dock vara i en vävnad som skyddas av nagelbanden dauer, som kan överleva hos dauerdjur, och ha en observerbar fenotyp i värden. Som sådan kan denna teknik användas för att berika andra mikrobiombakterier i tarmlumen förutom Alphaproteobacteria-arten som beskrivs här, inklusive bakterier som inte klibbar. Protokollet användes också för att berika för en fakultets intracellulär bakterie, Bordetella atropi, som infekterar nematoden Oscheius tipulae28. Efter berikning, B. atropi konstaterades bilda kolonier på NGM plattor, visar att en mikrob av intresse kan upptäckas vara odlingsbar in vitro när snabbare växande föroreningar tas bort. Denna teknik skulle sannolikt fungera för mikrosproider och virus, inklusive Orsay-viruset, med tanke på denna förmåga att berika en intracellulär bakterie. Dessa mikrober måste dock kunna överleva övergången till och från dauer.
Det är viktigt att komma ihåg att även om detta protokoll kan utföras i ett Biosafety Level 1-laboratorium, måste en steril teknik upprätthållas hela tiden för att förhindra ytterligare mikrobiell förorening. Protokollet kan ändras efter forskarens behov, inklusive typer/koncentrationer av antibiotika, procentandelen SDS och/eller tillsats av svampdödande medel som nystatin. Ofta kan antalet förorenande mikrober som finns i en vildisolerad nematod variera dramatiskt. Här användes den uppenbara förlusten av icke-OP50-1 E. coli tillväxt på NGM plattor som en avläsning för en ren nematod stam. Men det kan finnas icke-odlingsbara populationer av kontaminerande mikrober närvarande, så det är viktigt att genomföra en metagenomik metod såsom 16S rRNA amplicon sekvensering för att se omfattningen av förorening26. När maskstammen har rengjorts kan den frysas och lagras bort för framtida studier. Sammantaget tillåter detta protokoll forskare att berika okulturerbara mikrober i vilda nematoder, så att de kan studera effekter på värd fitness, karakterisera fenotyper av kolonisering eller infektion och dra nytta av genetiska verktyg för att förstå mekanismerna bakom värd-mikrob interaktioner.
The authors have nothing to disclose.
Tack till Dr. Christian Braendle och Centre Nationale de la Recherche Scientifique (CNRS) Nouragues Field Station.
Agarose | Fisher Scientific | BP1356 | |
10% SDS | Invitrogen | AM9822 | |
BD PrecisionGlide Needle – 26 G | Fisher Scientific | 305115 | |
Carbenicillin | Millipore-Sigma | C1389-1G | |
Cefotaxime | Millipore-Sigma | C7039-500mg | |
Chloramphenicol | Millipore-Sigma | C0378-25G | |
DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | 11-303C | |
DreamTaq Polymerase | Fisher Scientific | EP0711 | |
Gentamycin | Millipore-Sigma | G1264-250mg | |
Kanamycin | Millipore-Sigma | K1876-1G | |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P-286 | |
NaCl | Fisher Scientific | S-671 | |
NH4Cl | Fisher Scientific | A-661 | |
Streptomycin | Millipore-Sigma | S6501-50G | |
Tetracyclin | Millipore-Sigma | T7660-5G | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | |
Watch glasses | VWR | 470144-850 |