Bryst epitel og endotelcellespheroider som en potentiel funktionel in vitro-model til brystkræftforskning

Summary

Krydstale mellem bryst epitelceller og endotelceller vigtigere bidrager til brystkræft progression, tumorvækst, og metastaser. I denne undersøgelse, spheroids er blevet lavet af brystkræftceller sammen med vaskulære og / eller lymfe endotelceller og demonstrere deres anvendelighed som en in vitro-system til brystkræft forskning.

Abstract

Brystkræft er den hyppigste årsag til dødelighed hos kvinder. Væksten af brystkræftceller og deres efterfølgende metastaser er en nøglefaktor for dens progression. Selv om de mekanismer, der er involveret i at fremme brystkræft vækst er blevet intensivt undersøgt ved hjælp af monokulturer af brystkræftceller såsom MCF-7 celler, bidraget fra andre celletyper, såsom vaskulære og lymfe endotelceller, der er tæt involveret i tumorvækst, er ikke blevet undersøgt i dybden. Celle-celle interaktion spiller en central rolle i tumor vækst og progression. Neoangiogenese, eller udvikling af fartøjer, er afgørende for tumorvækst, mens lymfesystemet fungerer som en portal for kræftcellemigration og efterfølgende metastaser. Nylige undersøgelser giver bevis for, at vaskulære og lymfe endotelceller kan påvirke kræftcellevæksten betydeligt. Disse observationer indebærer et behov for at udvikle in vitro-modeller, der mere realistisk afspejler brystkræft vækstprocesser in vivo. Desuden kræver restriktioner inden for dyreforsøg, at der udvikles ex vivo-modeller for bedre at belyse de involverede mekanismer.

Denne artikel beskriver udviklingen af brystkræft spheroids består af både brystkræftceller (østrogen receptor-positive MCF-7 celler) og vaskulære og / eller lymfe endotelceller. Protokollen beskriver en detaljeret trin-for-trin tilgang til at skabe dual-celle spheroids ved hjælp af to forskellige tilgange, hængende drop (guld standard og billige) og 96-godt U-bund plader (dyrt). Der gives dybdegående instruktioner til, hvordan man forsigtigt afhenter de dannede spheroider for at overvåge væksten ved mikroskopisk dimensionering og vurdering af levedygtighed ved hjælp af døde og levende cellefarvninger. Desuden er procedurer til at fastsætte spheroids til sektionsafræning og farvning med vækstspecifikke antistoffer for at differentiere vækstmønstre i spheroider afgrænses. Derudover gives detaljer til fremstilling af spheroider med transfected celler og metoder til at udtrække RNA til molekylær analyse. Afslutningsvis giver denne artikel dybdegående instruktioner til forberedelse af multicellede spheroider til brystkræftforskning.

Introduction

Brugen af dyr til forsøg har begrænsninger. Dyreforsøg kan ikke nøjagtigt efterligne sygdomsprogression hos mennesker, og dyr og mennesker har ikke identiske reaktioner på patogener. Derudover er restriktioner i dyreforsøg på grund af bekymringer for dyrelidelser og etiske problemer^1,2 i stigende grad begrænse forskningsprogrammerne. In vitro der er udviklet systemer i vid udstrækning for at omgå brugen af dyr; desuden har brugen af menneskelige celler gjort in vitro modeller, der er mere relevante for den patofysiologiske og terapeutiske undersøgelse. Konventionelle monolayer (2D) cellekulturer er meget udbredt, fordi de efterligner humane væv til en vis grad. 2D-monokulturer efterligner imidlertid ikke menneskelige organer, og 2D-monokulturer er ikke i stand til at simulere det komplekse mikromiljø af de oprindelige organer og efterligne in vivo situation^3,4,5,6. Derudover, i monolayer celle kulturer, lægemiddelbehandlinger let kunne ødelægge / skade alle cellerne. Det er vigtigt, at nogle af disse begrænsninger kan overvindes ved at skifte til tredimensionelle (3D) cellekulturer (multilags)^7,8. Faktisk har 3D-kulturmodeller vist sig bedre at afspejle cellestrukturen, layoutet og funktionen af celler i primære væv. Disse 3D-kulturer kan dannes ved hjælp af en række cellelinjer, svarende til et funktionelt organ. Faktisk er der to modeller af 3D-kulturer. En model producerer spheroids af aggregerede celler, der danner klynger og reorganisere dem i kugler (stillads-fri modeller). Den anden giver organoider, som har en mere kompleks struktur og består af kombinationer af flere organspecifikke celler, der betragtes som en miniatureversion af organer^9,10. På grund af dette repræsenterer 3D-kultursystemer en innovativ teknologi med mange biologiske og kliniske anvendelser. Spheroider og organoider har således talrige anvendelser for sygdomsmodellering og undersøgelser relateret til regenerativ medicin, lægemiddelscreening og toksikologiske undersøgelser^{6,11,12,13,14,15}. Kræftfremkaldende spheroider, der stammer fra 3D-teknologi, genskabe morfologi og fænotype af relevante celletyper, efterligner in vivo tumor mikromiljø, og model cellekommunikation og signalering veje, der er operationelle under tumor udvikling^16,17,18. Hertil kommer, at forbedre kræft biologi forståelse, tumor spheroids / organoider kan også bruges til at identificere en potentiel patient-specifik anti-cancer terapi (personlig) og vurdere dens effektivitet, toksicitet, og langsigtede virkninger^19,20,21,22. Spheroids har åbnet fremtrædende muligheder for at undersøge patofysiologi, sygdom modellering og lægemiddelscreening på grund af deres evne til at bevare cellulære og tre-dimensionelle væv arkitektur, evnen til at efterligne in vivo og cellecelleinteraktionerne. Man skal dog også være opmærksom på begrænsningerne i dette system, såsom manglen på vaskulær/systemisk komponent, funktionel immun- eller nervesystem, og systemet repræsenterer en reduktionistisk tilgang sammenlignet med dyremodeller. I modsætning til dyremodeller giver 3D-strukturer faktisk kun en tilnærmelse af biologien i en menneskelig krop. Forståelse af begrænsningerne i 3D-metoden kan hjælpe forskere med at designe mere raffinerede og gyldige processer til fremstilling af spheroider, der bedre repræsenterer et organ i større skala^23,24,25.

Kræft er den hyppigste dødsårsag på verdensplan, og brystkræft er den mest almindelige kræftform hos kvinder^26,27,28. For at efterligne det komplekse mikromiljø af brystkræft, bør brystkræft spheroider dyrkes ved hjælp af celler, der spiller en fremtrædende rolle i brysttumorer, dvs epitelceller, endotelceller, fibroblaster, og / eller immunceller. Desuden, for en spheroid repræsenterer brystkræft, udtrykket af kvindelige hormon receptorer (østrogen / progesteron receptorer), evne til at bevare patientens tumor histologiske status, og evnen til at efterligne respons på terapi bør også overvejes. Undersøgelser har vist, at 3D co-kultur systemer har en cellulær organisation svarende til den primære væv in vivo, har evnen til at reagere i realtid til stimuli, og har funktionelle androgen receptorer^29,30,31,32. Derfor kan en lignende tilgang være nyttig til at efterligne en brystsvulst in vitro. Formålet med den nuværende protokol er at etablere en ny metode til at generere brystkræft spheroids. Denne metode udnytter østrogen receptor-positive MCF-7 celler (en udødeliggjort menneskelige celle linje af epitelceller) og vaskulære endotelceller (HUVECs) eller lymfe endotelceller (HMVEC-DNeo) til at skabe en model, der efterligner eller nøje afspejler samspillet mellem disse celler i en tumor. Selvom MCF-7 (østrogen-lydhør) og endotelceller er blevet brugt til at udvikle spheroids i denne undersøgelse, andre celler såsom fibroblaster, som repræsenterer ~ 80% af bryst tumor masse, kunne også kombineres i fremtiden for bedre at repræsentere og efterligne brysttumor.

Der er flere metoder til at danne spheroids, såsom: 1) den hængende dråbemetode, der anvender tyngdekraften^33,34; 2) den magnetiske levitationsmetode, der bruger magnetiske nanopartikler, der udsættes for en ekstern magnet³⁵, og 3) spheroid mikroplademetoden, der udføres ved at så celler på lavtilbehørsplader^36,37. På grundlag af de eksisterende metoder, som kun bruger én celletype, er den nuværende protokol blevet optimeret ved hjælp af epitel- og endotelceller for bedre at efterligne vækstbetingelserne for brystkræfttumorer i vivo^38,39,40,41. Denne metode kan nemt opnås i laboratoriet til en lav pris og med minimale udstyrskrav. Baseret på laboratoriets behov/mål blev forskellige tilgange brugt til at danne spheroider og få relevant cellulært materiale fra disse spheroider. I denne sammenhæng, for DNA, RNA, eller protein analyse, 3D spheroids er produceret af co-culturing endotel og epitelceller med hængende dråbe metode. Men for funktionelle undersøgelser, for eksempel, for at overvåge cellevækst efter kort interferens (siRNA) transfection og / eller hormonbehandling, spheroids genereres ved hjælp af U-bund plader.

Formålet med denne tekniske protokol er at give en detaljeret trinvis beskrivelse af 1) danner brystkræft multicellulære-type spheroids, 2) forberede prøver til histologisk farvning, og 3) indsamling af celler til udvinding af RNA, DNA og proteiner. Både den billige hængende dråbemetode og de dyrere U-bundplader bruges til at danne spheroids. Her leveres en protokol til forberedelse (fastsættelse) spheroider til sektion og efterfølgende immunstaining med markører for at vurdere cellespredning, apoptose og fordeling af epitel- og endotelceller i en spheroid. Derudover viser denne protokol en komplet trinvis analyse af histologiske data ved hjælp af ImageJ-software. Fortolkningen af biologiske data varierer afhængigt af eksperimenttypen og de anvendte antistoffer. Afsnit af faste spheroider og efterfølgende farvning af sektionerne blev udført af et rutinemæssigt patologisk laboratorium (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

Protocol

1. Cellekultur BEMÆRK: Udfør cellehåndtering under sterile forhold. Human Umbilical Vene EndotelCeller (HUVECs) subkultur Frakke 75 cm2 kollagen med kollagen (5 μg/cm2) (rottehale) natten over (ON) ved stuetemperatur (RT) eller 2-3 timer ved 37 °C, skyl med vand, og lad kolben tørre. Grow HUVECs i vækstmedium (EBM-2, Endotel basal medium-2) suppleret med glutamin (1x = 2 mM), antibiotisk-antimykotisk opløsning (AA; 100 μg/ml streptomy…

Representative Results

Spheroids model ved hjælp af epitel og endotel co-kulturer er forpligtet til nøje at efterligne in vivo betingelser for brysttumorer for in vitro eksperimenter. Ordningen i figur 1 skildrer protokollen om at danne spheroider med brystkræft epitelceller og vaskulære eller lymfe endotelceller (Figur 1). Hver celletype sås separat i en rund skål på 3,5 cm og behandles med vækststimulatorer/hæmmere eller transfected med oligoukleotider ved…

Discussion

Sammenlignet med 2D-cellekulturer er revolutionerende 3D-spheroidkulturteknologi et bedre og mere kraftfuldt værktøj til at rekonstruere et organs mikromiljø, cellecelleinteraktioner og lægemiddelrespons in vitro. Dette er den første protokol, der beskriver dannelsen af spheroider fra flercellede (epitel- og endotelcellelinjer) til brystkræftforskning. Denne protokol sikrer spheroidal 3D-vækst af spheroider i op til 5 dage, og spheroids kan undersøges efter paraffin indlejring, sektion og histologisk far…

Materials

100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes	Corning	CLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture Dish	Falcon	353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile	Falcon	357543
Adobe Photoshop			Version: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)	Sigma-Aldrich	A5955
Calcein-AM	Sigma-Aldrich	17783
CD31 (cluster of differentiation 31)	Cell Marque	131M-95	monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)	Invitrogen	C7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)	DBS	Mob189-05	monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted Microscope	Olympus Life Science		Olympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3	Cell Signaling	9661L	polyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail)	Roche	11 179 179 001
Coulter ISOTON II Diluent	Beckman Coulter	844 80 11	Diluent II
Coulter Z1, Cell Counter	Coulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble Agar	BD Difco	BD 214220
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma-Aldrich	D6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2	Lonza	190860
Ethidium homodimer	Sigma-Aldrich	46043
Fetal Calf Serum (FCS)	Thermo Fisher Scientific	SH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)	Thermo Fisher Scientific	SH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA	Leica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco	14175053
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Lonza	CC-2517
ImageJ	National Institute of Health, USA		Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit)
Ki67	Cell Marque	275R-16	monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome		149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Gibco	S003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line	Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich		Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plate	Thermo Fisher Scientific	174925
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x	Gibco	10010015
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Protein Lysis Buffer	Cell Signaling, Danvers, USA	9803
Quick-RNA Miniprep Kit	Zymo Research	R1055
RNA Lysis Buffer	Zymo Research	R1060-1-100	Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R Centrifuge	Hettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL	Falcon	352003
Sonicator	Bandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate reader	Tecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75	TPP	90076
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T3924