Articolo metodologico
La diafonia tra cellule epiteliali mammarie e cellule endoteliali contribuisce in modo importante alla progressione del cancro al seno, alla crescita del tumore e alle metastasi. In questo studio, gli sferoidi sono stati realizzati da cellule di cancro al seno insieme a cellule endoteliali vascolari e / o linfatiche e dimostrano la loro applicabilità come sistema in vitro per la ricerca sul cancro al seno.
Il cancro al seno è la principale causa di mortalità nelle donne. La crescita delle cellule del cancro al seno e le loro successive metastasi è un fattore chiave per la sua progressione. Sebbene i meccanismi coinvolti nella promozione della crescita del cancro al seno siano stati intensamente studiati utilizzando monocolture di cellule di cancro al seno come le cellule MCF-7, il contributo di altri tipi di cellule, come le cellule endoteliali vascolari e linfatiche che sono intimamente coinvolte nella crescita del tumore, non è stato studiato in profondità. L'interazione cellula-cellula svolge un ruolo chiave nella crescita e nella progressione del tumore. La neoangiogenesi, o lo sviluppo dei vasi, è essenziale per la crescita del tumore, mentre il sistema linfatico funge da portale per la migrazione delle cellule tumorali e le successive metastasi. Studi recenti forniscono la prova che le cellule endoteliali vascolari e linfatiche possono influenzare significativamente la crescita delle cellule tumorali. Queste osservazioni implicano la necessità di sviluppare modelli in vitro che riflettano più realisticamente i processi di crescita del cancro al seno in vivo. Inoltre, le restrizioni nella ricerca sugli animali richiedono lo sviluppo di modelli ex vivo per chiarire meglio i meccanismi coinvolti.
Questo articolo descrive lo sviluppo di sferoidi del cancro al seno composti sia da cellule di cancro al seno (cellule MCF-7 positive al recettore degli estrogeni) che da cellule endoteliali vascolari e / o linfatiche. Il protocollo descrive un approccio dettagliato passo-passo nella creazione di sferoidi a doppia cella utilizzando due diversi approcci, hanging drop (gold standard ed economico) e piastre a U a 96 pozzetti (costose). Vengono fornite istruzioni approfondite su come raccogliere delicatamente gli sferoidi formati per monitorare la crescita mediante dimensionamento microscopico e valutazione della vitalità utilizzando la colorazione di cellule morte e vive. Inoltre, vengono delineate le procedure per fissare gli sferoidi per il sezionamento e la colorazione con anticorpi specifici della crescita per differenziare i modelli di crescita negli sferoidi. Inoltre, vengono forniti dettagli per la preparazione di sferoidi con cellule trasfettate e metodi per estrarre l'RNA per l'analisi molecolare. In conclusione, questo articolo fornisce istruzioni approfondite per la preparazione di sferoidi multicellulari per la ricerca sul cancro al seno.
L'uso di animali per esperimenti ha dei limiti. Gli studi sugli animali non possono imitare accuratamente la progressione della malattia negli esseri umani e gli animali e gli esseri umani non hanno risposte identiche agli agenti patogeni. Inoltre, le restrizioni nella sperimentazione animale a causa delle preoccupazioni per la sofferenza degli animali e dei problemi etici1,2 vincolano sempre più i programmi di ricerca. In vitro sono stati ampiamente sviluppati sistemi per eludere l'uso degli animali; inoltre, l'uso di cellule umane ha reso in vitro modelli più rilevanti per l'indagine fisiop....
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1. Coltura cellulare
NOTA: Condurre la manipolazione delle cellule in condizioni sterili.
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Il modello di sferoidi che utilizza co-colture epiteliali ed endoteliali è necessario per imitare da vicino le condizioni in vivo dei tumori al seno per esperimenti in vitro. Lo schema in Figura 1 illustra il protocollo per formare sferoidi con cellule epiteliali del cancro al seno e cellule endoteliali vascolari o linfatiche (Figura 1). Ogni tipo di cellula viene seminato separatamente in un piatto rotondo di 3,5 cm e trattato con stimolatori/.......
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Rispetto alle colture cellulari 2D, la rivoluzionaria tecnologia di coltura sferoide 3D è uno strumento migliore e più potente per ricostruire il microambiente di un organo, le interazioni cellula-cellula e le risposte ai farmaci in vitro. Questo è il primo protocollo che descrive la formazione di sferoidi da linee cellulari multicellulari (epiteliali ed endoteliali) per la ricerca sul cancro al seno. Questo protocollo garantisce la crescita 3D sferoidale degli sferoidi per un massimo di 5 giorni e gli sferoidi .......
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questa ricerca è stata sostenuta dalla Cancer Research Foundation / Swiss Cancer League grant KFS-4125-02-2017 a RKD e National Institute of Health grant DK079307 a EKJ.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 100 mm & 20 mm Piastre di coltura trattate con colture tissutali | Corning | CLS430167 | |
| 149MULTI0C1 | |||
| Piastra per colture tissutali da 35 x 10 mm | Falcon | 353001 | |
| 5 mL Pipetta sierologica, polistirene, confezionato singolarmente, Falco sterile | 357543 | ||
| Adobe Photoshop | Versione: 13.0.1 (64- bit) | ||
| Soluzione antibiotica antimicotica (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Calcein-AM | Sigma-Aldrich | 17783 | |
| CD31 (cluster di differenziazione 31) | Cell Marque | 131M-95 | clone monoclonale di topo ab JC70 |
| CellTracker Green CMFDA (5-clorometilfluoresceina diacetato) | Invitrogen | C7025 | |
| CK8/18 (citocheratine 8 e 18) | DBS | Mob189-05 | monoclonale di topo ab, clone 5D3 |
| CKX41 Microscopio invertito | Olympus Life Science | Olympus DP27 fotocamera digitale | |
| Caspasi scissa 3 | Segnalazione cellulare | 9661L | coniglio policlonale ab |
| Collagene (coda di ratto) | Roche | 11 179 179 001 | |
| Coltro ISOTON II Diluente | Beckman Coulter | 844 80 11 | Diluente II |
| Coltro Z1, Contatore di cellule | Coulter Elettronica, Luton, Regno Unito | ||
| Terreni di coltura disidratati: Noble Agar | BD Difco | BD 214220 | |
| Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, donatori aggregati (HMVEC-DNeo) | Lonza | CC-2516 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco' s Aquila modificata' s Miscela Medium/Nutrienti F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D6434 | |
| EBM-2 Crescita delle cellule endoteliali Basal Medium-2 | Lonza | 190860 | |
| Etidio omodimero | Sigma-Aldrich | 46043 | |
| Siero fetale di vitello (FCS) | Thermo Fisher Scientific | SH30070 | |
| Siero fetale di vitello spogliato (FCS sf) | Thermo Fisher Scientific | SH3006803 | |
| Stereomicroscopi a fluorescenza Leica M205 FA | Leica Microsystems | ||
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050038 | |
| HBSS, senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo | Gibco | 14175053 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| HUVEC – Cellule endoteliali della vena ombelicale umana | Lonza | CC-2517 | |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | Wayne Rasband Versione: 1.52a (64 bit) | |
| Ki67 | Cell Marque | 275R-16 | coniglio monoclonale ab, clone SP6 |
| Leica stereomicroscopio a fluorescenza completamente motorizzato | Leica Microsystems | M205 FA | |
| Leica Histocore Multicut Kit | rotante 149MULTI0C1 | ||
| (kit LSGS) | Cellule Gibco | S003K | |
| MCF-7 - linea cellulare di adenocarcinoma mammario umano | Clinica per la ginecologia, Ospedale universitario di Zurigo | Nato dal dottor Andrè Fedier ha ottenuto da ATCC | |
| Nunclon Sphera 96U-well plate | Thermo Fisher Scientific | 174925 | |
| Paraformaldeide (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x | Gibco | 10010015 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protein Lysis Buffer | Cell Signaling, Danvers, USA | 9803 | |
| Kit Miniprep Quick-RNA | Zymo Research | R1055 | |
| Tampone per lisi dell'RNA | Zymo Research | R1060-1-100 | Contenuto in Kit Miniprep Quick-RNA |
| Rotina 46R Centrifuga | Hettich | ||
| Provette in polistirene a fondo tondo, 5 mL | Falcon | 352003 | |
| Sonicator | Bandelin electronics, Berlino, DE | ||
| Lettore di micropiastre Tecan serie Infinite M200 | Tecan, Salisburgo, AU | ||
| Fiasche per coltura tissutale 75 | TPP | 90076 | |
| Soluzione di tripsina-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 |
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