Mammary Epitheliale en Endotheelcel Sferoïden als een potentieel functioneel in vitro model voor borstkankeronderzoek
Summary
Kruisverwijzing tussen borstepitheelcellen en endotheelcellen draagt belangrijk bij aan de progressie van borstkanker, tumorgroei en metastase. In deze studie zijn sferoïden gemaakt van borstkankercellen samen met vasculaire en / of lymfatische endotheelcellen en tonen hun toepasbaarheid aan als een in vitro systeem voor borstkankeronderzoek.
Abstract
Borstkanker is de belangrijkste doodsoorzaak bij vrouwen. De groei van borstkankercellen en hun daaropvolgende metastase is een belangrijke factor voor de progressie ervan. Hoewel de mechanismen die betrokken zijn bij het bevorderen van de groei van borstkanker intensief zijn bestudeerd met behulp van monoculturen van borstkankercellen zoals MCF-7-cellen, is de bijdrage van andere celtypen, zoals vasculaire en lymfatische endotheelcellen die nauw betrokken zijn bij tumorgroei, niet diepgaand onderzocht. Cel-cel interactie speelt een sleutelrol in tumorgroei en progressie. Neoangiogenese, of de ontwikkeling van bloedvaten, is essentieel voor tumorgroei, terwijl het lymfestelsel dient als een portaal voor migratie van kankercellen en daaropvolgende metastase. Recente studies leveren bewijs dat vasculaire en lymfatische endotheelcellen de groei van kankercellen aanzienlijk kunnen beïnvloeden. Deze observaties impliceren een behoefte aan het ontwikkelen van in vitro modellen die de groeiprocessen van borstkanker in vivorealistischer zouden weergeven. Bovendien vereisen beperkingen in dieronderzoek de ontwikkeling van ex vivo modellen om de betrokken mechanismen beter te verduidelijken.
Dit artikel beschrijft de ontwikkeling van borstkanker sferoïden samengesteld uit zowel borstkankercellen (oestrogeen receptor-positieve MCF-7 cellen) en vasculaire en /of lymfatische endotheelcellen. Het protocol beschrijft een gedetailleerde stapsgewijze aanpak bij het maken van dual-cell sferoïden met behulp van twee verschillende benaderingen, hangende druppel (gouden standaard en goedkoop) en 96-goed U-bodemplaten (duur). Er worden diepgaande instructies gegeven voor het subtiel oppakken van de gevormde sferoïden om de groei te volgen door microscopische dimensionering en het beoordelen van de levensvatbaarheid met behulp van dode en levende celkleuring. Bovendien worden procedures om de sferoïden te fixeren voor sectie en kleuring met groeispecifieke antilichamen om groeipatronen in sferoïden te differentiëren, afgebakend. Daarnaast worden details verstrekt voor het bereiden van sferoïden met getransfecteerde cellen en methoden om RNA te extraheren voor moleculaire analyse. Kortom, dit artikel biedt diepgaande instructies voor het voorbereiden van meercellige sferoïden voor borstkankeronderzoek.
Introduction
Het gebruik van dieren voor experimenten heeft beperkingen. Dierstudies kunnen ziekteprogressie bij mensen niet nauwkeurig nabootsen en dieren en mensen hebben geen identieke reacties op pathogenen. Bovendien, beperkingen in dierproeven als gevolg van bezorgdheid over dierenleed en ethische problemen1,2 onderzoeksprogramma’s steeds meer beperken. In vitro er zijn op grote schaal systemen ontwikkeld om het gebruik van dieren te omzeilen; bovendien heeft het gebruik van menselijke cellen in vitro modellen die relevanter zijn voor het pathofysiologisch en therapeutisch onderzoek. Conventionele monolayer (2D) celculturen worden veel gebruikt omdat ze menselijke weefsels tot op zekere hoogte nabootsen. 2D-monoculturen slagen er echter niet in om menselijke organen na te bootsen en 2D-monoculturen zijn niet in staat om de complexe micro-omgeving van de oorspronkelijke organen te simuleren en de in vivo situatie3,4,5,6. Bovendien kunnen medicamenteuze behandelingen in monolaagcelculturen gemakkelijk alle cellen vernietigen / beschadigen. Belangrijk is dat sommige van deze beperkingen kunnen worden overwonnen door over te schakelen naar meerlaagse driedimensionale (3D) celculturen7,8. In feite is aangetoond dat 3D-kweekmodellen de cellulaire structuur, lay-out en functie van cellen in primaire weefsels beter weerspiegelen. Deze 3D-culturen kunnen worden gevormd met behulp van een verscheidenheid aan cellijnen, vergelijkbaar met een functioneel orgaan. Er zijn inderdaad twee modellen van 3D-culturen. Eén model produceert sferoïden van geaggregeerde cellen die clusters vormen en deze reorganiseren in bollen (steigervrije modellen). De tweede levert organoïden op, die een complexere structuur hebben en bestaan uit combinaties van meerdere orgaanspecifieke cellen, die worden beschouwd als een miniatuurversie van organen9,10. Hierdoor vertegenwoordigen 3D-kweeksystemen een innovatieve technologie met veel biologische en klinische toepassingen. Zo hebben sferoïden en organoïden tal van toepassingen voor ziektemodellering en studies met betrekking tot regeneratieve geneeskunde, geneesmiddelenscreening en toxicologische studies6,11,12,13,14,15. Kankerverwekkende sferoïden, afgeleid van 3D-technologie, recreëren de morfologie en het fenotype van relevante celtypen, bootsen de in vivo tumor micro-omgeving, en model cel communicatie en signalering routes die operationeel zijn tijdens de ontwikkeling van de tumor16,17,18. Bovendien, om het begrip van kankerbiologie te verbeteren, kunnen tumorsferoïden / organoïden ook worden gebruikt om een potentiële patiëntspecifieke antikankertherapie (gepersonaliseerd) te identificeren en de werkzaamheid, toxiciteit en langetermijneffecten ervan te beoordelen19,20,21,22. Sferoïden hebben prominente mogelijkheden geopend om pathofysiologie, ziektemodellering en medicijnscreening te onderzoeken vanwege hun vermogen om cellulaire en driedimensionale weefselarchitectuur te behouden, het vermogen om de in vivo situatie, en de cel-cel interacties. Men moet zich echter ook bewust zijn van de beperkingen van dit systeem, zoals het ontbreken van vasculaire / systemische component, functioneel immuunsysteem of zenuwstelsel, en het systeem vertegenwoordigt een reductionistische benadering in vergelijking met diermodellen. In tegenstelling tot diermodellen bieden 3D-structuren slechts een benadering van de biologie in een menselijk lichaam. Inzicht in de beperkingen van de 3D-methode kan onderzoekers helpen om meer verfijnde en geldige processen te ontwerpen voor het produceren van sferoïden die een orgaan op grotere schaal beter vertegenwoordigen23,24,25.
Kanker is wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak en borstkanker is de meest voorkomende kanker bij vrouwen van26,27,28jaar. Om de complexe micro-omgeving van borstkanker na te bootsen, moeten borstkankersferoïden worden gekweekt met behulp van cellen die een prominente rol spelen in borsttumoren, d.w.z. epitheelcellen, endotheelcellen, fibroblasten en / of immuuncellen. Bovendien moet voor een sferoïde die borstkanker vertegenwoordigt, ook de expressie van vrouwelijke hormoonreceptoren (oestrogeen / progesteronreceptoren), het vermogen om de histologische status van de tumor van de patiënt te behouden en het vermogen om de respons op therapie na te bootsen, worden overwogen. Studies hebben aangetoond dat 3D-co-kweeksystemen een cellulaire organisatie hebben die vergelijkbaar is met die van het primaire weefsel in vivo,de mogelijkheid hebben om in realtime te reageren op stimuli en functionele androgeenreceptorenhebben 29,30,31,32. Daarom kan een vergelijkbare aanpak nuttig zijn om een borsttumor in vitro na te bootsen. Het doel van het huidige protocol is om een nieuwe methode vast te stellen voor het genereren van sferoïden voor borstkanker. Deze methode maakt gebruik van oestrogeenreceptorpositieve MCF-7-cellen (een vereeuwigde menselijke cellijn van epitheelcellen) en vasculaire endotheelcellen (HUVECs) of lymfatische endotheelcellen (HMVEC-DNeo) om een model te creëren dat de interacties tussen deze cellen in een tumor nabootst of nauw weerspiegelt. Hoewel MCF-7 (oestrogeen-responsieve) en endotheelcellen in de huidige studie zijn gebruikt om sferoïden te ontwikkelen, kunnen andere cellen zoals fibroblasten die ~ 80% van de borsttumormassa vertegenwoordigen, in de toekomst ook worden gecombineerd om borsttumor beter weer te geven en na te bootsen.
Er zijn verschillende methoden om sferoïden te vormen, zoals: 1) de hangende druppelmethode die de zwaartekracht gebruikt33,34; 2) de magnetische levitatiemethode die magnetische nanodeeltjes gebruikt die zijn blootgesteld aan een externe magneet35,en 3) de sferoïde microplaatmethode die wordt uitgevoerd door zaaicellen op platen met een lage bevestiging36,37. Op basis van de bestaande methoden, die slechts één celtype gebruiken, is het huidige protocol geoptimaliseerd met behulp van epitheel- en endotheelcellen om de groeiomstandigheden van borstkankertumoren in vivobeter na te bootsen38,39,40,41. Deze methode kan eenvoudig worden bereikt in het laboratorium tegen lage kosten en met minimale apparatuurvereisten. Op basis van de behoefte / doelen van het lab werden verschillende benaderingen gebruikt om sferoïden te vormen en relevant cellulair materiaal uit deze sferoïden te halen. In deze context, voor DNA-, RNA- of eiwitanalyse, worden de 3D-sferoïden geproduceerd door co-cultivering van endotheel- en epitheelcellen met de hanging drop-methode. Voor functionele studies, bijvoorbeeld om de celgroei na korte interfererende (siRNA) transfectie en / of hormoonbehandeling te volgen, worden de sferoïden gegenereerd met behulp van U-bodemplaten.
Het doel van dit technische protocol is om een gedetailleerde stapsgewijze beschrijving te geven voor 1) het vormen van borstkanker meercellige sferoïden, 2) het voorbereiden van monsters voor histologische kleuring en 3) het verzamelen van cellen voor extractie van RNA, DNA en eiwitten. Zowel de goedkope hangdruppelmethode als de duurdere U-bodemplaten worden gebruikt om sferoïden te vormen. Hier wordt een protocol verstrekt voor het voorbereiden (fixeren) van sferoïden voor sectie en daaropvolgende immunostaining met markers om celproliferatie, apoptose en distributie van epitheel- en endotheelcellen binnen een sferoïde te beoordelen. Bovendien toont dit protocol een volledige stapsgewijze analyse van histologische gegevens met behulp van ImageJ-software. De interpretatie van biologische gegevens varieert afhankelijk van het type experiment en de gebruikte antilichamen. Sectie van vaste sferoïden en daaropvolgende kleuring van de secties werd uitgevoerd door een routine pathologielaboratorium (Sophistolab: info@sophistolab.ch)
Protocol
Representative Results
Discussion
In vergelijking met 2D-celculturen is revolutionaire 3D-sferoïde cultuurtechnologie een beter en krachtiger hulpmiddel om de micro-omgeving van een orgaan, cel-celinteracties en medicijnresponsen in vitrote reconstrueren. Dit is het eerste protocol dat de vorming van sferoïden uit meercellige (epitheliale en endotheel) cellijnen beschrijft voor borstkankeronderzoek. Dit protocol zorgt voor sferoïdale 3D-groei van sferoïden gedurende maximaal 5 dagen, en sferoïden kunnen worden onderzocht na paraffine-inbedd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door Cancer Research Foundation / Swiss Cancer League grant KFS-4125-02-2017 aan RKD en National Institute of Health grant DK079307 aan EKJ.
Materials
| 100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes | Corning | CLS430167 | |
| 149MULTI0C1 | |||
| 35 x 10 mm Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile | Falcon | 357543 | |
| Adobe Photoshop | Version: 13.0.1 (64-bit) | ||
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Calcein-AM | Sigma-Aldrich | 17783 | |
| CD31 (cluster of differentiation 31) | Cell Marque | 131M-95 | monoclonal mouse ab clone JC70 |
| CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | Invitrogen | C7025 | |
| CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) | DBS | Mob189-05 | monoclonal mouse ab, clone 5D3 |
| CKX41 Inverted Microscope | Olympus Life Science | Olympus DP27 digital camera | |
| Cleaved Caspase 3 | Cell Signaling | 9661L | polyclonal rabbit ab |
| Collagen (rat tail) | Roche | 11 179 179 001 | |
| Coulter ISOTON II Diluent | Beckman Coulter | 844 80 11 | Diluent II |
| Coulter Z1, Cell Counter | Coulter Electronics, Luton, UK | ||
| Dehydrated Culture Media: Noble Agar | BD Difco | BD 214220 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D6434 | |
| EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 | Lonza | 190860 | |
| Ethidium homodimer | Sigma-Aldrich | 46043 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher Scientific | SH30070 | |
| Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) | Thermo Fisher Scientific | SH3006803 | |
| Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA | Leica Microsystems | ||
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050038 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175053 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit) |
|
| Ki67 | Cell Marque | 275R-16 | monoclonal rabbit ab, clone SP6 |
| Leica Histocore Multicut Rotary Microtome | 149MULTI0C1 | ||
| Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) | Gibco | S003K | |
| MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line | Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich | Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC | |
| Nunclon Sphera 96U-well plate | Thermo Fisher Scientific | 174925 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010015 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protein Lysis Buffer | Cell Signaling, Danvers, USA | 9803 | |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | |
| RNA Lysis Buffer | Zymo Research | R1060-1-100 | Contents in Quick-RNA Miniprep Kit |
| Rotina 46R Centrifuge | Hettich | ||
| Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352003 | |
| Sonicator | Bandelin electronics, Berlin, DE | ||
| Tecan Infinite series M200 microplate reader | Tecan, Salzburg, AU | ||
| Tissue Culture Flasks 75 | TPP | 90076 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 |
Riferimenti
- Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary Pathology. 49 (3), 423-439 (2012).
- Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Developmental Cell. 18 (1), 8-23 (2010).
- Goodman, T. T., Ng, C. P., Pun, S. H. 3-D tissue culture systems for the evaluation and optimization of nanoparticle-based drug carriers. Bioconjugate Chemistry. 19 (10), 1951-1959 (2008).
- Yang, L., et al. Tumor organoids: From inception to future in cancer research. Cancer Letters. 454, 120-133 (2019).
- Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. The American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285 (2017).
- Sakalem, M. E., De Sibio, M. T., da Costa, F., de Oliveira, M. Historical evolution of spheroids and organoids, and possibilities of use in life sciences and medicine. Biotechnology Journal. 16 (5), (2021).
- Zanoni, M., et al. Modeling neoplastic disease with spheroids and organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 97 (2020).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (1), 151-165 (2020).
- Ding, Y., et al. Three-dimensional tissue culture model of human breast cancer for the evaluation of multidrug resistance. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 1959-1971 (2018).
- Little, M. H. Organoids: a special issue. Development. 144 (6), 935-937 (2017).
- Rimann, M., Graf-Hausner, U. Synthetic 3D multicellular systems for drug development. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 803-809 (2012).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Fong, E. L., et al. Modeling Ewing sarcoma tumors in vitro with 3D scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6500-6505 (2013).
- Hauptmann, S., et al. Integrin expression on colorectal tumor cells growing as monolayers, as multicellular tumor spheroids, or in nude mice. International Journal of Cancer. 61 (6), 819-825 (1995).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Ashok, A., Choudhury, D., Fang, Y., Hunziker, W. Towards manufacturing of human organoids. Biotechnology Advances. 39, 107460 (2020).
- Lehmann, R., et al. Human organoids: a new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
- Verjans, E. T., Doijen, J., Luyten, W., Landuyt, B., Schoofs, L. Three-dimensional cell culture models for anticancer drug screening: Worth the effort. Journal of Cellular Physiology. 233 (4), 2993-3003 (2018).
- Bombonati, A., Sgroi, D. C. The molecular pathology of breast cancer progression. The Journal of Pathology. 223 (2), 307-317 (2011).
- DeSantis, C., Ma, J., Bryan, L., Jemal, A. Breast cancer statistics, 2013. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 64 (1), 52-62 (2014).
- Solanki, M., Visscher, D. Pathology of breast cancer in the last half century. Human Pathology. 95, 137-148 (2020).
- Djomehri, S. I., Burman, B., Gonzalez, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2019).
- Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116 (2018).
- Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295-304 (2020).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2720 (2011).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Türker, E., Demirçak, N., Arslan-Yildiz, A. Scaffold-free three-dimensional cell culturing using magnetic levitation. Biomaterials Science. 6 (7), 1745-1753 (2018).
- Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: comparison of different protocols. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: Current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), 1329-1340 (2018).
- Marconi, A., Quadri, M., Saltari, A., Pincelli, C. Progress in melanoma modelling in vitro. Experimental Dermatology. 27 (5), 578-586 (2018).
- Saltari, A., et al. CD271 down-regulation promotes melanoma progression and invasion in three-dimensional models and in zebrafish. The Journal of Investigative Dermatology. 136 (10), 2049-2058 (2016).
- Yamauchi, M., et al. A novel in vitro survival assay of small intestinal stem cells after exposure to ionizing radiation. Journal of Radiation Research. 55 (2), 381-390 (2014).
- Jabs, J., et al. Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations. Molecular Systems Biology. 13 (11), 955 (2017).
- Arruabarrena-Aristorena, A., et al. FOXA1 mutations reveal distinct chromatin profiles and influence therapeutic response in breast cancer. Cancer Cell. 38 (4), 534-550 (2020).
- Carey, S. P., Starchenko, A., McGregor, A. L., Reinhart-King, C. A. Leading malignant cells initiate collective epithelial cell invasion in a three-dimensional heterotypic tumor spheroid model. Clinical & Experimental Metastasis. 30 (5), 615-630 (2013).
- Park, S., et al. Differential functions of splicing factors in mammary transformation and breast cancer metastasis. Cell Reports. 29 (9), 2672-2688 (2019).
- Truong, D. D., et al. A human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Ricerca sul cancro. 79 (12), 3139-3151 (2019).
- Zhang, J., et al. Energetic regulation of coordinated leader-follower dynamics during collective invasion of breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7867-7872 (2019).
- Jeong, Y. H., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45 (2020).
