유방암 연구를 위한 잠재적인 기능적인 시험관 내 모형으로 유방 상피 및 내피 세포 스페로이드
Summary
유방 상피 세포와 내피 세포 사이 교차 토크는 중요한 유방암 진행에 기여, 종양 성장, 및 전이. 이 연구에서는, 스페로이드는 혈관 및/또는 림프 성 내피 세포와 함께 유방암 세포에서 만들어졌으며 유방암 연구를위한 체외 시스템으로서 자신의 적용성을 입증했습니다.
Abstract
유방암은 여성의 사망의 주요 원인입니다. 유방암 세포의 성장과 후속 전이의 성장은 진행을위한 핵심 요소입니다. 유방암 성장 촉진에 관여하는 기전은 MCF-7 세포와 같은 유방암 세포의 단일 배양을 사용하여 집중적으로 연구되었지만 종양 성장에 밀접하게 관여하는 혈관 및 림프 내피 세포와 같은 다른 세포 유형의 기여는 깊이 조사되지 않았습니다. 세포 세포 상호 작용은 종양 성장 및 진행에 있는 중요한 역할을 합니다. 신경전증, 또는 혈관의 발달은 종양 성장에 필수적이지만 림프 계는 암 세포 이동 및 후속 전이를위한 포털 역할을합니다. 최근 연구는 혈관 및 림프 내피 세포가 암세포 성장에 크게 영향을 미칠 수 있다는 증거를 제공합니다. 이러한 관측은 생체 내 유방암 성장 과정을 보다 현실적으로 반영하는 체외 모델 개발의 필요성을 암시한다. 또한, 동물 연구의 제한은 관련된 메커니즘을 더 잘 해명하기 위해 전 생체 모델의 개발을 필요로한다.
이 문서는 유방암 세포 (에스트로겐 수용체 양성 MCF-7 세포) 및 혈관 및 /또는 림프 내피 세포로 구성된 유방암 스페로이드의 발달을 설명합니다. 이 프로토콜은 두 가지 접근 법, 매달려 드롭 (금 본위제 및 저렴한) 및 96 웰 U-바닥 플레이트 (비싼)를 사용하여 듀얼 셀 스페로이드를 만드는 상세한 단계별 접근 방식을 설명합니다. 형성된 스페로이드를 섬세하게 집어 들고 미세한 크기 조정및 죽은 세포 염색을 사용하여 생존 가능성을 평가하는 방법에 대한 심층 지침이 제공됩니다. 더욱이, 스페로이드의 성장 패턴을 차별화하기 위해 성장특이적 항체로 단면화 및 염색을 위한 스페로이드를 고치는 절차가 묘사된다. 또한, 세포분석용 RNA를 추출하는 방법 및 전염된 세포와 함께 스페로이드를 준비하기 위한 세부 사항이 제공된다. 결론적으로, 이 문서는 유방암 연구를 위한 다세포 스페로이드를 준비하기 위한 심층적인 지침을 제공합니다.
Introduction
실험을 위해 동물을 사용하는 것은 한계가 있습니다. 동물 연구는 인간에 있는 질병 진행을 정확하게 모방할 수 없고, 동물과 인간은 병원체에 동일 반응이 없습니다. 또한, 동물의 고통과 윤리적 문제에 대한 우려로 인한 동물 실험 제한1,2 점점 더 제약 연구 프로그램. In vitro 동물의 사용을 우회하기 위해 널리 개발된 시스템; 더욱이, 인간 세포의 사용은 in vitro 병리학 및 치료 조사에 더 관련성이 있는 모델. 종래의 단층(2D) 세포 배양은 인간 조직을 어느 정도 모방하기 때문에 널리 사용된다. 그러나, 2D 단배양은 인간 장기를 모방하지 못하며, 2D 단배양은 원래 장기의 복잡한 미세 환경을 시뮬레이션할 수 없으며 in vivo 상황3,4,5,6. 추가적으로, 단층 세포 배양에서, 약 처리는 쉽게 파괴/모든 세포를 손상할 수 있었습니다. 중요한 것은, 다층 3차원(3D) 세포 배양으로 전환하여 이러한 한계 중 일부를 극복할 수 있다는 것입니다.7,8. 실제로, 3D 배양 모델은 1차 조직에서 세포의 세포 구조, 레이아웃 및 기능을 더 잘 반영하는 것으로 나타났습니다. 이러한 3D 배양은 기능성 기관과 유사한 다양한 세포주를 사용하여 형성될 수 있다. 실제로 3D 문화권에는 두 가지 모델이 있습니다. 한 모델은 클러스터를 형성하고 구체(스캐폴드 프리 모델)로 재구성하는 집계된 셀의 스페로이드를 생성합니다. 두 번째는 더 복잡한 구조를 가지고 장기 의 소형 버전으로 간주되는 다중 장기 특정 세포의 조합으로 구성된 오르가노이드를 산출합니다.9,10. 이로 인해 3D 배양 시스템은 많은 생물학적 및 임상 응용 분야의 혁신적인 기술을 나타냅니다. 따라서, 스페로이드와 오르가노이드는 재생 의학, 약물 선별 및 독성 연구와 관련된 질병 모델링 및 연구에 대한 수많은 응용 프로그램을 가지고 있습니다.6,11,12,13,14,15. 3D 기술에서 파생된 발암 성 스페로이드는 관련 세포 유형의 형태와 표현형을 재현하여 모방합니다. in vivo 종양 미세 환경, 및 종양 발달 중에 작동하는 세포 통신 및 신호 경로 모델16,17,18. 또한, 암 생물학 이해를 향상시키기 위하여는, 종양 스페로이드/organoids는 또한 잠재적인 환자 특정 항암 치료 (개인화)를 확인하고 그것의 효험, 독성 및 장기 효력을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다19,20,21,22. 스페로이드는 세포 및 3차원 조직 아키텍처를 보존하는 능력, 모방 능력 으로 인해 병리학, 질병 모델링 및 약물 검진을 조사할 수 있는 두드러진 기회를 열었습니다. in vivo 상황 및 세포 세포 상호 작용. 그러나 혈관/전신 성분의 부족, 기능성 면역 또는 신경계 와 같은 이 시스템의 한계를 알고 있어야 하며, 이 시스템은 동물 모델에 비해 환원주의적 접근법을 나타낸다. 실제로, 동물 모델과는 달리, 3D 구조는 인체 내의 생물학의 근사치만을 제공합니다. 3D 방법의 한계를 이해하면 연구원들이 더 큰 규모의 장기를 더 잘 나타내는 스페로이드를 생산하기 위한 보다 세련되고 유효한 프로세스를 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다.23,24,25.
암은 전 세계적으로 사망의 주요 원인이며, 유방암은 여자26,27,28에서가장 흔한 암이다. 유방암의 복잡한 미세 환경을 모방하기 위하여는, 유방암 스페로이드는 유방 종양, 즉 상피 세포, 내피 세포, 섬유아세포 및/또는 면역 세포에서 중요한 역할을 하는 세포를 사용하여 배양되어야 합니다. 더욱이, 유방암을 대표하는 스페로이드의 경우, 여성 호르몬 수용체(에스트로겐/황체호르몬 수용체)의 발현, 환자 종양 조직 상태를 보존하는 능력, 치료에 대한 반응을 모방하는 능력도 고려해야 한다. 연구에 따르면 3D 공동배양 시스템은 생체 내의1차 조직과 유사한 세포 조직을 가지고 있으며, 자극에 실시간으로 반응할 수 있는 능력을 가지며, 기능성 안드로겐수용체(29,30,31,32)를갖는다. 따라서, 유사한 접근은 시험관내유방 종양을 모방하기 위하여 유용할 수 있었습니다. 현재 프로토콜의 목적은 유방암 스페로이드를 생성하는 새로운 방법을 확립하는 것입니다. 이 방법은 에스트로겐 수용체 양성 MCF-7 세포(상피 세포의 불멸의 인간 세포주) 및 혈관 내피 세포(HUVECs) 또는 림프 내피 세포(HMVEC-DNeo)를 활용하여 종양 내의 이들 세포 간의 상호 작용을 모방하거나 밀접하게 반영하는 모델을 생성한다. MCF-7 (에스트로겐 반응성) 및 내피 세포는 본 연구에서 스페로이드를 개발하는 데 사용되었지만, 유방 종양 질량의 ~80 %를 나타내는 섬유 아세포와 같은 다른 세포는 향후 유방 종양을 더 잘 표현하고 모방하기 위해 결합 될 수 있습니다.
같은 스페로이드를 형성하는 몇 가지 방법이 있습니다: 1) 중력을 사용하는 걸이 액적 방법(33,34; 2) 외부자석(35)및 3) 저부착 플레이트(36,37)에서세포를 파종하여 수행되는 스페로이드 마이크로플레이트 방법을 사용하는 자기 적발 방법. 하나의 세포 유형만을 사용하는 기존 방법에 기초하여, 본 프로토콜은 생체 내 유방암 종양의 성장 조건을 더 잘 모방하기 위해 상피 및 내피 세포를 사용하여 최적화되어 있으며, 생체 내유방암 종양의 성장 조건을 더 잘 모방하였다38,39,40,41. 이 방법은 저렴한 비용으로 최소한의 장비 요구 사항으로 실험실에서 쉽게 달성 할 수 있습니다. 실험실의 필요/목표에 따라, 다른 접근 은 스페로이드를 형성 하 고 이러한 스페로이드에서 관련 된 세포 물질을 얻기 위해 사용 되었다. 이러한 맥락에서, DNA, RNA 또는 단백질 분석을 위해, 3D 스페로이드는 매달려 있는 낙하 방법과 함께 내피 및 상피 세포를 공동 배양하여 생성된다. 그러나, 기능적 연구를 위해, 예를 들어, 짧은 간섭 후 세포 성장을 모니터링 (siRNA) transfection 및/또는 호르몬 치료, 스페로이드는 U-바닥 플레이트를 사용하여 생성된다.
이 기술 프로토콜의 목적은 1) 유방암 다세포 형 스페로이드를 형성하는 1) 형성에 대한 상세한 단계별 설명을 제공하는 것입니다, 2) 조직학적 염색을위한 샘플을 준비, 및 3) RNA의 추출을위한 세포의 수집, DNA, 및 단백질. 저렴한 매달려 드롭 방법과 더 비싼 U-바닥 플레이트모두 스페로이드를 형성하는 데 사용됩니다. 여기서, 세포 증식, 세포 세포 증식, 세포 멸폐, 및 스페로이드 내내피 세포의 분포를 평가하기 위해 마커로 단면화 및 후속 면역스테인링을 위한 스페로이드를 준비하기 위한 프로토콜이 제공된다. 또한 이 프로토콜은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 조직학적 데이터의 전체 단계별 분석을 보여 주습니다. 생물학적 데이터의 해석은 실험의 유형과 사용되는 항체에 따라 다릅니다. 고정 스페로이드의 단면 과 섹션의 후속 염색은 일상적인 병리학 실험실에 의해 수행되었다 (Sophistolab: info@sophistolab.ch)
Protocol
Representative Results
Discussion
2D 세포 배양에 비해 혁신적인 3D 스페로이드 배양 기술은 기관의 미세 환경, 세포 세포 상호 작용 및 체외에서약물 반응을 재구성하는 더 강력하고 강력한 도구입니다. 이것은 유방암 연구를 위한 다세포 (상피 및 내피) 세포주에서 스페로이드의 대형을 기술하는 첫번째 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 최대 5일 동안 스페로이드의 스페로이드 3D 성장을 보장하고, 파라핀 포함, 단면 및 조직?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 암 연구 재단 / 스위스 암 리그 보조금 KFS-4125-02-2017RKD 및 국립 보건 연구소에 의해 지원되었다 EKJ에.
Materials
| 100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes | Corning | CLS430167 | |
| 149MULTI0C1 | |||
| 35 x 10 mm Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile | Falcon | 357543 | |
| Adobe Photoshop | Version: 13.0.1 (64-bit) | ||
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Calcein-AM | Sigma-Aldrich | 17783 | |
| CD31 (cluster of differentiation 31) | Cell Marque | 131M-95 | monoclonal mouse ab clone JC70 |
| CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | Invitrogen | C7025 | |
| CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) | DBS | Mob189-05 | monoclonal mouse ab, clone 5D3 |
| CKX41 Inverted Microscope | Olympus Life Science | Olympus DP27 digital camera | |
| Cleaved Caspase 3 | Cell Signaling | 9661L | polyclonal rabbit ab |
| Collagen (rat tail) | Roche | 11 179 179 001 | |
| Coulter ISOTON II Diluent | Beckman Coulter | 844 80 11 | Diluent II |
| Coulter Z1, Cell Counter | Coulter Electronics, Luton, UK | ||
| Dehydrated Culture Media: Noble Agar | BD Difco | BD 214220 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D6434 | |
| EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 | Lonza | 190860 | |
| Ethidium homodimer | Sigma-Aldrich | 46043 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher Scientific | SH30070 | |
| Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) | Thermo Fisher Scientific | SH3006803 | |
| Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA | Leica Microsystems | ||
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050038 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175053 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit) |
|
| Ki67 | Cell Marque | 275R-16 | monoclonal rabbit ab, clone SP6 |
| Leica Histocore Multicut Rotary Microtome | 149MULTI0C1 | ||
| Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) | Gibco | S003K | |
| MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line | Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich | Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC | |
| Nunclon Sphera 96U-well plate | Thermo Fisher Scientific | 174925 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010015 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protein Lysis Buffer | Cell Signaling, Danvers, USA | 9803 | |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | |
| RNA Lysis Buffer | Zymo Research | R1060-1-100 | Contents in Quick-RNA Miniprep Kit |
| Rotina 46R Centrifuge | Hettich | ||
| Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352003 | |
| Sonicator | Bandelin electronics, Berlin, DE | ||
| Tecan Infinite series M200 microplate reader | Tecan, Salzburg, AU | ||
| Tissue Culture Flasks 75 | TPP | 90076 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 |
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