Pattedyr epitel- og endotelcellesfæroider som en potensiell funksjonell in vitro-modell for brystkreftforskning

Summary

Krysstale mellom pattedyr epitelceller og endotelceller bidrar viktig til brystkreftprogresjon, tumorvekst og metastase. I denne studien er sfæroider laget av brystkreftceller sammen med vaskulære og/eller lymfatiske endotelceller og viser deres anvendbarhet som et in vitro-system for brystkreftforskning.

Abstract

Brystkreft er den ledende årsaken til dødelighet hos kvinner. Veksten av brystkreftceller og deres påfølgende metastase er en nøkkelfaktor for progresjonen. Selv om mekanismene for å fremme brystkreftvekst har blitt intensivt studert ved hjelp av monokulturer av brystkreftceller som MCF-7-celler, har bidraget fra andre celletyper, som vaskulære og lymfatiske endotelceller som er intimt involvert i tumorvekst, ikke blitt undersøkt i dybden. Cellecelleinteraksjon spiller en nøkkelrolle i tumorvekst og progresjon. Neoangiogenese, eller utvikling av fartøy, er avgjørende for tumorvekst, mens lymfesystemet fungerer som en portal for kreftcellemigrasjon og påfølgende metastase. Nyere studier gir bevis på at vaskulære og lymfatiske endotelceller kan påvirke kreftcelleveksten betydelig. Disse observasjonene innebærer et behov for å utvikle in vitro-modeller som mer realistisk vil gjenspeile brystkreftvekstprosesser in vivo. Videre krever restriksjoner i dyreforskning utvikling av ex vivo-modeller for å belyse bedre mekanismene som er involvert.

Denne artikkelen beskriver utviklingen av brystkreft sfæroider sammensatt av både brystkreftceller (østrogenreseptor-positive MCF-7 celler) og vaskulære og / eller lymfatiske endotelceller. Protokollen beskriver en detaljert trinnvis tilnærming til å lage tocellede sfæroider ved hjelp av to forskjellige tilnærminger, hengende fall (gullstandard og billig) og 96-brønns U-bunnplater (dyrt). Grundige instruksjoner er gitt for hvordan du delikat kan plukke opp de dannede sfæroidene for å overvåke vekst ved mikroskopisk størrelse og vurdere levedyktighet ved hjelp av død og levende cellefarging. Videre avgrenses prosedyrer for å fikse sfæroidene for seksjonering og farging med vekstspesifikke antistoffer for å skille vekstmønstre i sfæroider. I tillegg er detaljer for å forberede sfæroider med transfekterte celler og metoder for å trekke ut RNA for molekylær analyse gitt. Til slutt gir denne artikkelen grundige instruksjoner for å forberede flercellede sfæroider for brystkreftforskning.

Introduction

Bruken av dyr til eksperimenter har begrensninger. Dyrestudier kan ikke nøyaktig etterligne sykdomsprogresjon hos mennesker, og dyr og mennesker har ikke identiske svar på patogener. I tillegg er restriksjoner i dyreforsøk på grunn av bekymringer for dyrelidelse og etiske problemer^1,2 i økende grad begrense forskningsprogrammer. In vitro systemer har blitt mye utviklet for å omgå bruken av dyr; Videre har bruken av humane celler gjort at in vitro modeller som er mer relevante for den patofysiologiske og terapeutiske undersøkelsen. Konvensjonelle monolayer (2D) cellekulturer er mye brukt fordi de etterligner menneskelig vev til en viss grad. Imidlertid klarer ikke 2D-monokulturer å etterligne menneskelige organer, og 2D-monokulturer er ikke i stand til å simulere det komplekse mikromiljøet i de opprinnelige organene og etterligne in vivo situasjon^3,4,5,6. I tillegg, i monolayer cellekulturer, narkotika behandlinger kan lett ødelegge / skade alle cellene. Det er viktig at noen av disse begrensningene overvinnes ved å bytte til tredimensjonale cellekulturer med flere lag (3D)^7,8. Faktisk har 3D-kulturmodeller vist seg å bedre gjenspeile cellulær struktur, layout og funksjon av celler i primærvev. Disse 3D-kulturene kan dannes ved hjelp av en rekke cellelinjer, som ligner et funksjonelt organ. Faktisk er det to modeller av 3D-kulturer. En modell produserer sfæroider av aggregerte celler som danner klynger og omorganiserer dem til sfærer (stillasfrie modeller). Den andre gir organoider, som har en mer kompleks struktur og består av kombinasjoner av flere organspesifikke celler, som betraktes som en miniatyrversjon av organer.^9,10. På grunn av dette representerer 3D-kultursystemer en innovativ teknologi med mange biologiske og kliniske applikasjoner. Dermed har sfæroider og organoider mange anvendelser for sykdomsmodellering og studier relatert til regenerativ medisin, legemiddelscreening og toksikologiske studier.^{6,11,12,13,14,15}. Kreftfremkallende sfæroider, avledet fra 3D-teknologi, gjenskaper morfologien og fenotypen til relevante celletyper, etterligner in vivo tumormikromiljø, og modellcellekommunikasjon og signalveier som er operative under tumorutvikling^16,17,18. I tillegg, for å forbedre kreftbiologiforståelsen, kan tumorsfæroider/organoider også brukes til å identifisere en potensiell pasientspesifikk antikreftbehandling (personlig) og vurdere effekt, toksisitet og langsiktige effekter.^19,20,21,22. Sfæroider har åpnet fremtredende muligheter for å undersøke patofysiologi, sykdomsmodellering og legemiddelscreening på grunn av deres evne til å bevare cellulær og tredimensjonal vevsarkitektur, evnen til å etterligne in vivo og cellecelleinteraksjonene. Imidlertid må man også være klar over begrensningene i dette systemet, for eksempel mangel på vaskulær / systemisk komponent, funksjonelt immun- eller nervesystem, og systemet representerer en reduksjonistisk tilnærming sammenlignet med dyremodeller. Faktisk, i motsetning til dyremodeller, gir 3D-strukturer bare en tilnærming av biologien i en menneskekropp. Å forstå begrensningene i 3D-metoden kan hjelpe forskere med å designe mer raffinerte og gyldige prosesser for å produsere sfæroider som bedre representerer et organ i større skala.^23,24,25.

Kreft er den ledende dødsårsaken over hele verden, og brystkreft er den vanligste kreftformen hos kvinner^26,27,28. For å etterligne den komplekse mikromiljøet av brystkreft, bør brystkreftsfæroider dyrkes ved hjelp av celler som spiller en fremtredende rolle i brysttumorer, det vil si epitelceller, endotelceller, fibroblaster og / eller immunceller. Videre, for en sfæroid som representerer brystkreft, bør uttrykket av kvinnelige hormonreseptorer (østrogen / progesteronreseptorer), evne til å bevare pasientens tumor histologisk status, og evne til å etterligne respons på terapi også vurderes. Studier har vist at 3D-samkultursystemer har en cellulær organisasjon som ligner på det primære vevet in vivo, har evnen til å reagere i sanntid på stimuli, og har funksjonelle androgenreseptorer^29,30,31,32. Derfor kan en lignende tilnærming være nyttig for å etterligne en brystsvulst in vitro. Formålet med den nåværende protokollen er å etablere en ny metode for å generere brystkreftsfæroider. Denne metoden benytter østrogenreseptorpositive MCF-7-celler (en udødeliggjort human cellelinje av epitelceller) og vaskulære endotelceller (HUVEC) eller lymfatiske endotelceller (HMVEC-DNeo) for å lage en modell som etterligner eller reflekterer samspillet mellom disse cellene i en svulst. Selv om MCF-7 (østrogenresponsive) og endotelceller har blitt brukt til å utvikle sfæroider i den nåværende studien, kan andre celler som fibroblaster som representerer ~ 80% av brystsvulstmassen, også kombineres i fremtiden for bedre å representere og etterligne brystsvulst.

Det finnes flere metoder for å danne sfæroider, for eksempel: 1) den hengende dråpemetoden som bruker tyngdekraften^33,34; 2) den magnetiske levitasjonsmetoden som bruker magnetiske nanopartikler utsatt for en ekstern magnet³⁵, og 3) sfæroidmikroplatemetoden som utføres av såingsceller på lavfesteplater^36,37. På grunnlag av de eksisterende metodene, som bare bruker en celletype, har den nåværende protokollen blitt optimalisert ved hjelp av epitelceller og endotelceller for bedre å etterligne vekstforholdene til brystkreftsvulster i vivo^38,39,40,41. Denne metoden kan enkelt oppnås i laboratoriet til en lav pris og med minimale utstyrskrav. Basert på laboratoriets behov/mål ble ulike tilnærminger brukt til å danne sfæroider og få relevant cellulært materiale fra disse sfæroidene. I denne sammenhengen, for DNA-, RNA- eller proteinanalyse, produseres 3D-sfæroidene ved å kokulturere endotelceller og epitelceller med hengende dråpemetode. Men for funksjonelle studier, for eksempel for å overvåke cellevekst etter kort forstyrrende (siRNA) transfeksjon og / eller hormonbehandling, genereres sfæroidene ved hjelp av U-bunnplater.

Formålet med denne tekniske protokollen er å gi en detaljert trinnvis beskrivelse for 1) som danner multicellulære sfæroider av brystkreft, 2) forberede prøver for histologisk farging, og 3) samling av celler for utvinning av RNA, DNA og proteiner. Både den billige hengende dråpemetoden og de dyrere U-bunnplatene brukes til å danne sfæroider. Her er det gitt en protokoll for å forberede (fikse) sfæroider for seksjonering og påfølgende immunostaining med markører for å vurdere celleproliferasjon, apoptose og distribusjon av epitelceller og endotelceller i en sfæroid. I tillegg viser denne protokollen en komplett trinnvis analyse av histologiske data ved hjelp av ImageJ-programvare. Tolkning av biologiske data varierer avhengig av type eksperiment og antistoffene som brukes. Seksjonering av faste sfæroider og etterfølgende farging av seksjonene ble utført av et rutinemessig patologilaboratorium (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

Protocol

1. Cellekultur MERK: Utfør cellehåndtering under sterile forhold. Human Navlestreng Vene Endotelceller (HUVEC) subkultur Strøk 75 cm2 kolber med kollagen (5 μg/cm2) (rottehale) over natten (ON) ved romtemperatur (RT) eller 2-3 t ved 37 °C, skyll med vann og la kolben tørke. Vokse HUVECs i vekstmedium (EBM-2, Endotelial Basal Medium-2) supplert med glutamin (1x = 2 mM), antibiotika-antimykotisk løsning (AA; 100 μg/ml streptomycin, 100 ?…

Representative Results

Sfæroidmodellen ved hjelp av epitel- og endotelkulturer er nødvendig for å etterligne in vivo-forhold av brystsvulster for in vitro-eksperimenter. Ordningen i figur 1 skildrer protokollen for å danne sfæroider med brystkreft epitelceller og vaskulære eller lymfatiske endotelceller (figur 1). Hver celletype frøes separat i en 3,5 cm rund tallerken og behandles med vekststimulatorer/-hemmere eller transfektert med oligonukleotider ved hjel…

Discussion

Sammenlignet med 2D-cellekulturer er revolusjonerende 3D-sfæroidkulturteknologi et bedre og kraftigere verktøy for å rekonstruere et organs mikromiljø, cellecelleinteraksjoner og legemiddelresponser in vitro. Dette er den første protokollen som beskriver dannelsen av sfæroider fra multicellulære (epiteliale og endoteliale) cellelinjer for brystkreftforskning. Denne protokollen sikrer sfæroidal 3D-vekst av sfæroider i opptil 5 dager, og sfæroider kan undersøkes etter parafininnbygging, seksjonering og …

Materials

100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes	Corning	CLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture Dish	Falcon	353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile	Falcon	357543
Adobe Photoshop			Version: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)	Sigma-Aldrich	A5955
Calcein-AM	Sigma-Aldrich	17783
CD31 (cluster of differentiation 31)	Cell Marque	131M-95	monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)	Invitrogen	C7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)	DBS	Mob189-05	monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted Microscope	Olympus Life Science		Olympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3	Cell Signaling	9661L	polyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail)	Roche	11 179 179 001
Coulter ISOTON II Diluent	Beckman Coulter	844 80 11	Diluent II
Coulter Z1, Cell Counter	Coulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble Agar	BD Difco	BD 214220
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma-Aldrich	D6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2	Lonza	190860
Ethidium homodimer	Sigma-Aldrich	46043
Fetal Calf Serum (FCS)	Thermo Fisher Scientific	SH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)	Thermo Fisher Scientific	SH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA	Leica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco	14175053
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Lonza	CC-2517
ImageJ	National Institute of Health, USA		Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit)
Ki67	Cell Marque	275R-16	monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome		149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Gibco	S003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line	Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich		Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plate	Thermo Fisher Scientific	174925
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x	Gibco	10010015
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Protein Lysis Buffer	Cell Signaling, Danvers, USA	9803
Quick-RNA Miniprep Kit	Zymo Research	R1055
RNA Lysis Buffer	Zymo Research	R1060-1-100	Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R Centrifuge	Hettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL	Falcon	352003
Sonicator	Bandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate reader	Tecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75	TPP	90076
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T3924