Eferóides de células epiteliais e endoteliais como um modelo in vitro potencial funcional para pesquisa de câncer de mama

Summary

O crosstalk entre células epiteliais mamárias e células endoteliais contribui importantemente para a progressão do câncer de mama, crescimento do tumor e metástase. Neste estudo, os esferoides foram feitos a partir de células cancerígenas de mama juntamente com células endoteliais vasculares e/ou linfáticas e demonstram sua aplicabilidade como um sistema in vitro para pesquisa de câncer de mama.

Abstract

O câncer de mama é a principal causa de mortalidade em mulheres. O crescimento das células cancerígenas de mama e sua metástase subsequente é um fator-chave para sua progressão. Embora os mecanismos envolvidos na promoção do crescimento do câncer de mama tenham sido intensamente estudados utilizando monoculturas de células cancerígenas de mama, como as células MCF-7, a contribuição de outros tipos celulares, como células endoteliais vasculares e linfáticas que estão intimamente envolvidas no crescimento do tumor, não tem sido investigada em profundidade. A interação célula-célula desempenha um papel fundamental no crescimento e progressão do tumor. A neoangiogênese, ou o desenvolvimento de vasos, é essencial para o crescimento do tumor, enquanto o sistema linfático serve como um portal para a migração de células cancerígenas e metástase subsequente. Estudos recentes fornecem evidências de que células endoteliais vasculares e linfáticas podem influenciar significativamente o crescimento de células cancerosas. Essas observações implicam a necessidade de desenvolver modelos in vitro que reflitam de forma mais realista os processos de crescimento do câncer de mama in vivo. Além disso, as restrições na pesquisa animal exigem o desenvolvimento de modelos ex vivo para elucidar melhor os mecanismos envolvidos.

Este artigo descreve o desenvolvimento de esferoides de câncer de mama compostos tanto de células cancerígenas de mama (células mcf-7 positivas do receptor de estrogênio) quanto de células endoteliais vasculares e/ou linfáticas. O protocolo descreve uma abordagem detalhada passo a passo na criação de esferoides de células duplas usando duas abordagens diferentes, queda suspensa (padrão ouro e barato) e placas de fundo U de 96 poços (caras). Instruções aprofundadas são fornecidas para como captar delicadamente os esferoides formados para monitorar o crescimento através do dimensionamento microscópico e avaliando a viabilidade usando manchas de células mortas e vivas. Além disso, são delineados procedimentos para fixação dos esferoides para secção e coloração com anticorpos específicos para o crescimento para diferenciar padrões de crescimento em esferoides. Além disso, são fornecidos detalhes para a preparação de esferoides com células transfectadas e métodos para extrair RNA para análise molecular. Em conclusão, este artigo fornece instruções aprofundadas para a preparação de esferoides multicelulares para a pesquisa do câncer de mama.

Introduction

O uso de animais para experimentos tem limitações. Estudos em animais não podem imitar com precisão a progressão da doença em humanos, e animais e humanos não têm respostas idênticas a patógenos. Além disso, restrições na experimentação animal devido a preocupações com o sofrimento animal e problemas éticos^1,2 cada vez mais restringe programas de pesquisa. In vitro sistemas têm sido amplamente desenvolvidos para contornar o uso de animais; além disso, o uso de células humanas fez in vitro modelos mais relevantes para a investigação fisiofisiológica e terapêutica. Culturas celulares monocamadas convencionais (2D) são amplamente utilizadas porque imitam tecidos humanos até certo ponto. No entanto, as monoculturas 2D não imitam órgãos humanos, e as monoculturas 2D são incapazes de simular o microambiente complexo dos órgãos originais e imitar o in vivo situação^3,4,5,6. Além disso, nas culturas de células monocamadas, os tratamentos medicamentosos podem facilmente destruir/danificar todas as células. É importante ressaltar que algumas dessas limitações podem ser superadas mudando para culturas celulares tridimensionais multicamadas (3D)^7,8. De fato, modelos de cultura 3D têm sido mostrados para refletir melhor a estrutura celular, layout e função das células nos tecidos primários. Essas culturas 3D podem ser formadas usando uma variedade de linhas celulares, semelhantes a um órgão funcional. Na verdade, existem dois modelos de culturas 3D. Um modelo produz esferoides de células agregadas que formam clusters e as reorganizam em esferas (modelos livres de andaimes). O segundo produz organoides, que possuem uma estrutura mais complexa e consistem em combinações de múltiplas células específicas de órgãos, que são consideradas como uma versão em miniatura de órgãos^9,10. Devido a isso, os sistemas de cultura 3D representam uma tecnologia inovadora com muitas aplicações biológicas e clínicas. Assim, esferoides e organoides têm inúmeras aplicações para modelagem de doenças e estudos relacionados à medicina regenerativa, rastreamento de medicamentos e estudos toxicológicos^{6,11,12,13,14,15}. Esferoides cancerígenos, derivados da tecnologia 3D, recriam a morfologia e o fenótipo de tipos celulares relevantes, imitam o in vivo microambiente tumoral, e modelo de comunicações celulares e vias de sinalização que estão operacionais durante o desenvolvimento do tumor^16,17,18. Além disso, para melhorar a compreensão da biologia do câncer, os esferoides/organoides tumorais também podem ser usados para identificar uma potencial terapia anticâncer específica do paciente (personalizada) e avaliar sua eficácia, toxicidade e efeitos a longo prazo^19,20,21,22. Esferoides abriram oportunidades proeminentes para investigar a fisiopatologia, modelagem de doenças e rastreamento de medicamentos devido à sua capacidade de preservar a arquitetura celular e tridimensional do tecido, a capacidade de imitar o in vivo situação, e as interações célula-célula. No entanto, deve-se também estar atento às limitações desse sistema, como a falta de componente vascular/sistêmico, sistema imunológico funcional ou nervoso, e o sistema representa uma abordagem reducionista em relação aos modelos animais. De fato, ao contrário dos modelos animais, as estruturas 3D fornecem apenas uma aproximação da biologia dentro de um corpo humano. Entender as limitações do método 3D pode ajudar os pesquisadores a projetar processos mais refinados e válidos para a produção de esferoides que melhor representam um órgão em maior escala^23,24,25.

O câncer é a principal causa de morte em todo o mundo, e o câncer de mama é o câncer mais comum em mulheres^26,27,28. Para imitar o complexo microambiente do câncer de mama, os esferoides do câncer de mama devem ser cultivados usando células que desempenham um papel proeminente nos tumores mamários, ou seja, células epiteliais, células endoteliais, fibroblastos e/ou células imunes. Além disso, para um esferoide representando o câncer de mama, a expressão dos receptores hormonais femininos (receptores de estrogênio/progesterona), a capacidade de conservar o tumor do paciente status histológico e a capacidade de imitar a resposta à terapia também devem ser consideradas. Estudos têm demonstrado que os sistemas de cocultura 3D possuem uma organização celular semelhante à do tecido primário in vivo,têm a capacidade de reagir em tempo real a estímulos, e possuem receptores andrógenos funcionais^29,30,31,32. Assim, uma abordagem semelhante poderia ser útil para imitar um tumor de mama in vitro. O objetivo do protocolo atual é estabelecer um novo método de geração de esferoides de câncer de mama. Este método utiliza células MCF-7 receptores estrógenos positivos (uma linha celular humana imortalizada de células epiteliais) e células endoteliais vasculares (HUVECs) ou células endoteliais linfáticas (HMVEC-DNeo) para criar um modelo que imita ou reflete de perto as interações entre essas células dentro de um tumor. Embora as células MCF-7 (responsivas ao estrogênio) e as células endoteliais tenham sido usadas para desenvolver esferoides no presente estudo, outras células, como os fibroblastos que representam ~80% da massa tumor do mama, também poderiam ser combinadas no futuro para representar e imitar melhor o tumor mamário.

Existem vários métodos para formar esferoides, tais como: 1) o método de gotícula suspensa que emprega a gravidade^33,34; 2) o método de levitação magnética que utiliza nanopartículas magnéticas expostas a um ímã externo³⁵, e 3) o método de microplaca esferoide que é realizado por células semeadas em placas de baixa fixação^36,37. Com base nos métodos existentes, que utilizam apenas um tipo de célula, o presente protocolo tem sido otimizado utilizando células epiteliais e endoteliais para melhor imitar as condições de crescimento dos tumores de câncer de mama in vivo^38,39,40,41. Este método pode ser facilmente alcançado em laboratório a um baixo custo e com requisitos mínimos de equipamento. Com base na necessidade/objetivos do laboratório, diferentes abordagens foram utilizadas para formar esferoides e obter material celular relevante a partir desses esferoides. Neste contexto, para análise de DNA, RNA ou proteína, os esferoides 3D são produzidos por células endoteliais e epiteliais com o método de queda suspensa. No entanto, para estudos funcionais, por exemplo, para monitorar o crescimento celular após transfecção de interferência curta (siRNA) e/ou tratamento hormonal, os esferoides são gerados usando placas de fundo U.

O objetivo deste protocolo técnico é fornecer uma descrição detalhada passo a passo para 1) formação de esferoides multicelulares do câncer de mama, 2) preparando amostras para coloração histológica e 3) coleta de células para extração de RNA, DNA e proteínas. Tanto o método de queda de suspensão barato quanto as placas inferiores U mais caras são usadas para formar esferoides. Aqui, é fornecido um protocolo de preparação (fixação) de esferoides para secção e imunostenção subsequente com marcadores para avaliar a proliferação celular, apoptose e distribuição de células epiteliais e endoteliais dentro de um esferoide. Além disso, este protocolo mostra uma análise completa passo a passo dos dados histológicos usando o software ImageJ. A interpretação dos dados biológicos varia dependendo do tipo de experimento e dos anticorpos utilizados. A secção de esferoides fixos e a posterior coloração das seções foram realizadas por um laboratório de patologia de rotina (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

Protocol

1. Cultura celular NOTA: Conduzir o manuseio da célula em condições estéreis. Subcultura de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) Cubra 75 cm2 frascos com colágeno (5 μg/cm2) (rabo-de-rato) durante a noite (ON) à temperatura ambiente (RT) ou 2-3 h a 37 °C, enxágue com água e deixe o frasco secar. Crescer HUVECs em meio de crescimento (EBM-2, Endotelial Basal Medium-2) suplementados com glutamina (1x = 2 mM), soluçã…

Representative Results

O modelo de esferoides usando coculturas epiteliais e endoteliais é necessário para imitar de perto as condições in vivo dos tumores mamários para experimentos in vitro. O esquema na Figura 1 retrata o protocolo para formar esferoides com células epiteliais de câncer de mama e células endoteliais vasculares ou linfáticas(Figura 1). Cada tipo de célula é semeada separadamente em um prato redondo de 3,5 cm e tratada com estimuladores/i…

Discussion

Em comparação com as culturas celulares 2D, a revolucionária tecnologia de cultura esferoide 3D é uma ferramenta melhor e mais poderosa para reconstruir o microambiente de um órgão, interações células-células e respostas medicamentosas in vitro. Este é o primeiro protocolo que descreve a formação de esferoides a partir de linhas celulares multicelulares (epiteliais e endoteliais) para a pesquisa do câncer de mama. Este protocolo garante o crescimento 3D esferoidal de esferoides por até 5 dias, e o…

Materials

100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes	Corning	CLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture Dish	Falcon	353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile	Falcon	357543
Adobe Photoshop			Version: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)	Sigma-Aldrich	A5955
Calcein-AM	Sigma-Aldrich	17783
CD31 (cluster of differentiation 31)	Cell Marque	131M-95	monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)	Invitrogen	C7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)	DBS	Mob189-05	monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted Microscope	Olympus Life Science		Olympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3	Cell Signaling	9661L	polyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail)	Roche	11 179 179 001
Coulter ISOTON II Diluent	Beckman Coulter	844 80 11	Diluent II
Coulter Z1, Cell Counter	Coulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble Agar	BD Difco	BD 214220
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma-Aldrich	D6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2	Lonza	190860
Ethidium homodimer	Sigma-Aldrich	46043
Fetal Calf Serum (FCS)	Thermo Fisher Scientific	SH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)	Thermo Fisher Scientific	SH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA	Leica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco	14175053
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Lonza	CC-2517
ImageJ	National Institute of Health, USA		Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit)
Ki67	Cell Marque	275R-16	monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome		149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Gibco	S003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line	Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich		Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plate	Thermo Fisher Scientific	174925
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x	Gibco	10010015
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Protein Lysis Buffer	Cell Signaling, Danvers, USA	9803
Quick-RNA Miniprep Kit	Zymo Research	R1055
RNA Lysis Buffer	Zymo Research	R1060-1-100	Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R Centrifuge	Hettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL	Falcon	352003
Sonicator	Bandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate reader	Tecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75	TPP	90076
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T3924