Сфероиды эпителиальных и эндотелиальных клеток молочной железы как потенциальная функциональная модель in vitro для исследований рака молочной железы
Summary
Перекрестные помехи между эпителиальными клетками молочной железы и эндотелиальными клетками в значительной степени способствуют прогрессированию рака молочной железы, росту опухоли и метастазированию. В этом исследовании сфероиды были изготовлены из клеток рака молочной железы вместе с сосудистыми и / или лимфатическими эндотелиальными клетками и демонстрируют их применимость в качестве системы in vitro для исследования рака молочной железы.
Abstract
Рак молочной железы является основной причиной смертности у женщин. Рост клеток рака молочной железы и их последующее метастазирование является ключевым фактором его прогрессирования. Хотя механизмы, участвующие в стимулировании роста рака молочной железы, интенсивно изучались с использованием монокультур клеток рака молочной железы, таких как клетки MCF-7, вклад других типов клеток, таких как сосудистые и лимфатические эндотелиальные клетки, которые тесно участвуют в росте опухоли, не был глубоко изучен. Клеточно-клеточное взаимодействие играет ключевую роль в росте и прогрессировании опухоли. Неоангиогенез, или развитие сосудов, необходим для роста опухоли, тогда как лимфатическая система служит порталом для миграции раковых клеток и последующего метастазирования. Недавние исследования свидетельствуют о том, что сосудистые и лимфатические эндотелиальные клетки могут значительно влиять на рост раковых клеток. Эти наблюдения подразумевают необходимость разработки моделей in vitro, которые более реалистично отражали бы процессы роста рака молочной железы in vivo. Кроме того, ограничения в исследованиях на животных требуют разработки моделей ex vivo, чтобы лучше прояснить задействованные механизмы.
В этой статье описывается развитие сфероидов рака молочной железы, состоящих как из клеток рака молочной железы (эстроген-рецептор-положительные клетки MCF-7), так и сосудистых и /или лимфатических эндотелиальных клеток. Протокол описывает подробный пошаговый подход к созданию двухэлементных сфероидов с использованием двух разных подходов: висячие капли (золотой стандарт и дешевизна) и 96-луночные U-образные нижние пластины (дорогие). Приведены подробные инструкции о том, как деликатно подобрать сформированные сфероиды для мониторинга роста путем микроскопических размеров и оценки жизнеспособности с использованием окрашивания мертвых и живых клеток. Кроме того, очерчены процедуры фиксации сфероидов для сечения и окрашивания специфическими для роста антителами для дифференциации паттернов роста в сфероидах. Дополнительно приведены подробности получения сфероидов с трансфектированными клетками и методы извлечения РНК для молекулярного анализа. В заключение, в этой статье приведены подробные инструкции по подготовке многоклеточных сфероидов для исследования рака молочной железы.
Introduction
Использование животных для экспериментов имеет ограничения. Исследования на животных не могут точно имитировать прогрессирование заболевания у людей, а животные и люди не имеют одинаковых реакций на патогены. Кроме того, ограничения в экспериментах на животных из-за опасений по поводу страданий животных и этических проблем1,2 все больше ограничивают исследовательские программы. In vitro системы были широко разработаны для обхода использования животных; более того, использование человеческих клеток сделало in vitro модели, более актуальные для патофизиологического и терапевтического исследования. Обычные монослойные (2D) клеточные культуры широко используются, потому что они в некоторой степени имитируют ткани человека. Однако 2D-монокультуры не могут имитировать человеческие органы, а 2D-монокультуры не могут имитировать сложное микроокружение исходных органов и имитировать in vivo ситуация3,4,5,6. Кроме того, в монослойных клеточных культурах медикаментозное лечение может легко уничтожить / повредить все клетки. Важно отметить, что некоторые из этих ограничений могут быть преодолены путем перехода на многослойные трехмерные (3D) клеточные культуры.7,8. Фактически, было показано, что модели 3D-культур лучше отражают клеточную структуру, расположение и функцию клеток в первичных тканях. Эти 3D-культуры могут быть сформированы с использованием различных клеточных линий, похожих на функциональный орган. Действительно, существует две модели 3D-культур. Одна модель производит сфероиды агрегированных клеток, которые образуют кластеры и реорганизуют их в сферы (модели без каркасов). Второй дает органоиды, которые имеют более сложную структуру и состоят из комбинаций множественных орган-специфических клеток, которые рассматриваются как миниатюрная версия органов.9,10. Благодаря этому системы 3D-культур представляют собой инновационную технологию со многими биологическими и клиническими применениями. Таким образом, сфероиды и органоиды имеют многочисленные применения для моделирования заболеваний и исследований, связанных с регенеративной медициной, скринингом лекарств и токсикологическими исследованиями.6,11,12,13,14,15. Канцерогенные сфероиды, полученные из 3D-технологии, воссоздают морфологию и фенотип соответствующих типов клеток, имитируют in vivo микроокружение опухоли и моделирование клеточных коммуникаций и сигнальных путей, которые функционируют во время развития опухоли16,17,18. Кроме того, чтобы улучшить понимание биологии рака, сфероиды / органоиды опухоли также могут быть использованы для идентификации потенциальной специфической для пациента противораковой терапии (персонализированной) и оценки ее эффективности, токсичности и долгосрочных эффектов.19,20,21,22. Сфероиды открыли выдающиеся возможности для исследования патофизиологии, моделирования заболеваний и скрининга лекарств из-за их способности сохранять клеточную и трехмерную тканевую архитектуру, способности имитировать in vivo ситуация и клеточно-клеточные взаимодействия. Тем не менее, необходимо также знать об ограничениях этой системы, таких как отсутствие сосудистого / системного компонента, функциональной иммунной или нервной системы, и система представляет собой редукционистский подход по сравнению с животными моделями. Действительно, в отличие от животных моделей, 3D-структуры обеспечивают лишь приближение биологии в человеческом теле. Понимание ограничений 3D-метода может помочь исследователям разработать более совершенные и валидные процессы для получения сфероидов, которые лучше представляют орган в большем масштабе.23,24,25.
Рак является основной причиной смерти во всем мире, а рак молочной железы является наиболее распространенным раком у женщин26,27,28лет. Чтобы имитировать сложное микроокружение рака молочной железы, сфероиды рака молочной железы следует культивировать с использованием клеток, которые играют заметную роль в опухолях молочной железы, то есть эпителиальных клеток, эндотелиальных клеток, фибробластов и / или иммунных клеток. Кроме того, для сфероида, представляющего рак молочной железы, также следует учитывать экспрессию рецепторов женских гормонов (рецепторов эстрогена / прогестерона), способность сохранять гистологический статус опухоли пациента и способность имитировать ответ на терапию. Исследования показали, что 3D кокультурные системы имеют клеточную организацию, аналогичную таковой первичной ткани in vivo,обладают способностью реагировать в режиме реального времени на раздражители и имеют функциональные андрогенные рецепторы29,30,31,32. Следовательно, подобный подход может быть полезен для имитации опухоли молочной железы in vitro. Целью текущего протокола является установление нового метода генерации сфероидов рака молочной железы. Этот метод использует эстроген-рецептор-положительные клетки MCF-7 (увековеченная клеточная линия эпителиальных клеток человека) и сосудистые эндотелиальные клетки (HUVECs) или лимфатические эндотелиальные клетки (HMVEC-DNeo) для создания модели, которая имитирует или близко отражает взаимодействия между этими клетками в опухоли. Хотя MCF-7 (эстроген-чувствительные) и эндотелиальные клетки были использованы для разработки сфероидов в настоящем исследовании, другие клетки, такие как фибробласты, которые составляют ~ 80% массы опухоли молочной железы, также могут быть объединены в будущем, чтобы лучше представлять и имитировать опухоль молочной железы.
Существует несколько методов образования сфероидов, таких как: 1) метод висячих капель, который использует гравитацию33,34; 2) метод магнитной левитации, использующий магнитные наночастицы, подвергающиеся воздействию внешнего магнита35,и 3) сфероидный микропластинчатый метод, который выполняется путем посева клеток на пластины с низким креплением36,37. На основе существующих методов, в которых используется только один тип клеток, настоящий протокол был оптимизирован с использованием эпителиальных и эндотелиальных клеток для лучшей имитации условий роста опухолей рака молочной железы in vivo38,39,40,41. Этот метод может быть легко достигнут в лаборатории при низких затратах и с минимальными требованиями к оборудованию. Основываясь на потребностях / целях лаборатории, были использованы различные подходы для формирования сфероидов и получения соответствующего клеточного материала из этих сфероидов. В этом контексте для анализа ДНК, РНК или белка 3D-сфероиды производятся путем совместного культивирования эндотелиальных и эпителиальных клеток методом висячей капли. Однако для функциональных исследований, например, для мониторинга роста клеток после короткой интерферирующей (siRNA) трансфекции и/или гормональной терапии, сфероиды генерируются с использованием U-нижних пластин.
Целью данного технического протокола является предоставление подробного пошагового описания 1) формирования сфероидов многоклеточного типа рака молочной железы, 2) подготовки образцов для гистологического окрашивания и 3) сбора клеток для экстракции РНК, ДНК и белков. Для формирования сфероидов используется как недорогой метод подвесных капель, так и более дорогие U-образные пластины. Здесь представлен протокол подготовки (фиксации) сфероидов к разделению и последующему иммуноокрашиванию маркерами для оценки пролиферации клеток, апоптоза и распределения эпителиальных и эндотелиальных клеток внутри сфероида. Кроме того, этот протокол показывает полный пошаговый анализ гистологических данных с использованием программного обеспечения ImageJ. Интерпретация биологических данных варьируется в зависимости от типа эксперимента и используемых антител. Секционирование фиксированных сфероидов и последующее окрашивание срезов выполнялось обычной лабораторией патологии (Sophistolab: info@sophistolab.ch)
Protocol
Representative Results
Discussion
По сравнению с 2D-клеточными культурами, революционная технология 3D-сфероидных культур является лучшим и более мощным инструментом для реконструкции микросреды органа, клеточных взаимодействий и реакций на лекарства in vitro. Это первый протокол, описывающий образование сфероидов и?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантом Фонда исследований рака / Швейцарской онкологической лиги KFS-4125-02-2017 для RKD и грантом Национального института здравоохранения DK079307 для EKJ.
Materials
| 100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes | Corning | CLS430167 | |
| 149MULTI0C1 | |||
| 35 x 10 mm Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile | Falcon | 357543 | |
| Adobe Photoshop | Version: 13.0.1 (64-bit) | ||
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Calcein-AM | Sigma-Aldrich | 17783 | |
| CD31 (cluster of differentiation 31) | Cell Marque | 131M-95 | monoclonal mouse ab clone JC70 |
| CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | Invitrogen | C7025 | |
| CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) | DBS | Mob189-05 | monoclonal mouse ab, clone 5D3 |
| CKX41 Inverted Microscope | Olympus Life Science | Olympus DP27 digital camera | |
| Cleaved Caspase 3 | Cell Signaling | 9661L | polyclonal rabbit ab |
| Collagen (rat tail) | Roche | 11 179 179 001 | |
| Coulter ISOTON II Diluent | Beckman Coulter | 844 80 11 | Diluent II |
| Coulter Z1, Cell Counter | Coulter Electronics, Luton, UK | ||
| Dehydrated Culture Media: Noble Agar | BD Difco | BD 214220 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D6434 | |
| EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 | Lonza | 190860 | |
| Ethidium homodimer | Sigma-Aldrich | 46043 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher Scientific | SH30070 | |
| Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) | Thermo Fisher Scientific | SH3006803 | |
| Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA | Leica Microsystems | ||
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050038 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175053 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit) |
|
| Ki67 | Cell Marque | 275R-16 | monoclonal rabbit ab, clone SP6 |
| Leica Histocore Multicut Rotary Microtome | 149MULTI0C1 | ||
| Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) | Gibco | S003K | |
| MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line | Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich | Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC | |
| Nunclon Sphera 96U-well plate | Thermo Fisher Scientific | 174925 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010015 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protein Lysis Buffer | Cell Signaling, Danvers, USA | 9803 | |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | |
| RNA Lysis Buffer | Zymo Research | R1060-1-100 | Contents in Quick-RNA Miniprep Kit |
| Rotina 46R Centrifuge | Hettich | ||
| Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352003 | |
| Sonicator | Bandelin electronics, Berlin, DE | ||
| Tecan Infinite series M200 microplate reader | Tecan, Salzburg, AU | ||
| Tissue Culture Flasks 75 | TPP | 90076 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 |
Riferimenti
- Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary Pathology. 49 (3), 423-439 (2012).
- Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Developmental Cell. 18 (1), 8-23 (2010).
- Goodman, T. T., Ng, C. P., Pun, S. H. 3-D tissue culture systems for the evaluation and optimization of nanoparticle-based drug carriers. Bioconjugate Chemistry. 19 (10), 1951-1959 (2008).
- Yang, L., et al. Tumor organoids: From inception to future in cancer research. Cancer Letters. 454, 120-133 (2019).
- Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. The American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285 (2017).
- Sakalem, M. E., De Sibio, M. T., da Costa, F., de Oliveira, M. Historical evolution of spheroids and organoids, and possibilities of use in life sciences and medicine. Biotechnology Journal. 16 (5), (2021).
- Zanoni, M., et al. Modeling neoplastic disease with spheroids and organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 97 (2020).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (1), 151-165 (2020).
- Ding, Y., et al. Three-dimensional tissue culture model of human breast cancer for the evaluation of multidrug resistance. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 1959-1971 (2018).
- Little, M. H. Organoids: a special issue. Development. 144 (6), 935-937 (2017).
- Rimann, M., Graf-Hausner, U. Synthetic 3D multicellular systems for drug development. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 803-809 (2012).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Fong, E. L., et al. Modeling Ewing sarcoma tumors in vitro with 3D scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6500-6505 (2013).
- Hauptmann, S., et al. Integrin expression on colorectal tumor cells growing as monolayers, as multicellular tumor spheroids, or in nude mice. International Journal of Cancer. 61 (6), 819-825 (1995).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Ashok, A., Choudhury, D., Fang, Y., Hunziker, W. Towards manufacturing of human organoids. Biotechnology Advances. 39, 107460 (2020).
- Lehmann, R., et al. Human organoids: a new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
- Verjans, E. T., Doijen, J., Luyten, W., Landuyt, B., Schoofs, L. Three-dimensional cell culture models for anticancer drug screening: Worth the effort. Journal of Cellular Physiology. 233 (4), 2993-3003 (2018).
- Bombonati, A., Sgroi, D. C. The molecular pathology of breast cancer progression. The Journal of Pathology. 223 (2), 307-317 (2011).
- DeSantis, C., Ma, J., Bryan, L., Jemal, A. Breast cancer statistics, 2013. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 64 (1), 52-62 (2014).
- Solanki, M., Visscher, D. Pathology of breast cancer in the last half century. Human Pathology. 95, 137-148 (2020).
- Djomehri, S. I., Burman, B., Gonzalez, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2019).
- Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116 (2018).
- Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295-304 (2020).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2720 (2011).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Türker, E., Demirçak, N., Arslan-Yildiz, A. Scaffold-free three-dimensional cell culturing using magnetic levitation. Biomaterials Science. 6 (7), 1745-1753 (2018).
- Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: comparison of different protocols. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: Current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), 1329-1340 (2018).
- Marconi, A., Quadri, M., Saltari, A., Pincelli, C. Progress in melanoma modelling in vitro. Experimental Dermatology. 27 (5), 578-586 (2018).
- Saltari, A., et al. CD271 down-regulation promotes melanoma progression and invasion in three-dimensional models and in zebrafish. The Journal of Investigative Dermatology. 136 (10), 2049-2058 (2016).
- Yamauchi, M., et al. A novel in vitro survival assay of small intestinal stem cells after exposure to ionizing radiation. Journal of Radiation Research. 55 (2), 381-390 (2014).
- Jabs, J., et al. Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations. Molecular Systems Biology. 13 (11), 955 (2017).
- Arruabarrena-Aristorena, A., et al. FOXA1 mutations reveal distinct chromatin profiles and influence therapeutic response in breast cancer. Cancer Cell. 38 (4), 534-550 (2020).
- Carey, S. P., Starchenko, A., McGregor, A. L., Reinhart-King, C. A. Leading malignant cells initiate collective epithelial cell invasion in a three-dimensional heterotypic tumor spheroid model. Clinical & Experimental Metastasis. 30 (5), 615-630 (2013).
- Park, S., et al. Differential functions of splicing factors in mammary transformation and breast cancer metastasis. Cell Reports. 29 (9), 2672-2688 (2019).
- Truong, D. D., et al. A human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Ricerca sul cancro. 79 (12), 3139-3151 (2019).
- Zhang, J., et al. Energetic regulation of coordinated leader-follower dynamics during collective invasion of breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7867-7872 (2019).
- Jeong, Y. H., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45 (2020).
