Här presenteras ett protokoll för den standardiserade metoden för beredning av gnagarevävnad efter ischemi-reperfusionsexperimentet och riktlinjer för att upprätta belysnings- och kamerainställningar för högupplöst bildförvärv. Denna metod är tillämplig på all experimentell smådjursorganfotografering.
Makrofotografering är tillämplig för avbildning av olika vävnadsprover vid hög förstoring för att utföra kvalitativa och kvantitativa analyser. Vävnadsberedning och efterföljande bildtagning är steg som utförs omedelbart efter ischemi-reperfusionsexperimentet (IR) och måste utföras i tid och med lämplig försiktighet. För utvärdering av IR-inducerad skada i hjärtat och hjärnan beskriver detta papper 2,3,5-trifenyl-2H-tetrazoliumklorid (TTC) -baserad färgning följt av makrofotografering. Vetenskaplig makrofotografering kräver kontrollerad belysning och en lämplig bildinställning. Den standardiserade metoden säkerställer högkvalitativa, detaljerade digitala bilder även om en kombination av en billig uppdaterad digitalkamera och makrolins används. Korrekta tekniker och potentiella misstag i provberedning och bildförvärv diskuteras, och exempel på påverkan av korrekta och felaktiga inställningar på bildkvaliteten tillhandahålls. Specifika tips ges om hur man undviker vanliga misstag, såsom överlagring, felaktig provlagring och suboptimala ljusförhållanden. Detta dokument visar lämplig metod för skivning och färgning av råtthjärta och hjärnvävnad och ger riktlinjer för att upprätta belysnings- och kamerainställningar och fotograferingstekniker för högupplöst bildförvärv.
I årtionden har fotografering och analys av hjärt- och hjärnvävnadsprover varit en viktig del av life science-experiment. Vetenskapliga och innovativa framsteg driver utvecklingen av dyra mikroskop som kan ersättas. Fotomikrografer erhålls i en välkontrollerad ljusmiljö enligt detaljerade instruktioner. Däremot utförs makrofotografering (vid 1: 2 eller högre förstoring) ofta i en okontrollerad ljusmiljö med hjälp av olämpliga bildinställningar. Ofta måste teknikerna för provberedning och kamerainställning optimeras väsentligt. Som ett resultat har makrofotografier av begränsad kvalitet publicerats i stor utsträckning i vetenskapliga tidskrifter. Otillräcklig bildupplösning och kontrast begränsar möjligheterna till exakt bildkvantifiering i IR-studier.
Experimentella förfaranden för hjärtinfarkt1,2 och hjärna3,4 infarkter har beskrivits i detalj. Syftet med denna studie är att ge en steg-för-steg-guide om hur man sätter upp ett system för fotografering och standardiserad analys av gnagares hjärt- och hjärnvävnadsprover efter infarktexperiment. Detta inkluderar vävnads skivning, färgning och makrofotografering av hjärt- och hjärnprover. Beredningen av vävnadsprover är en väsentlig del av experimentet, och de planimetriska bildanalysresultaten beror i hög grad på kvaliteten på de erhållna bilderna5.
Dessa metoder är särskilt användbara för att utföra mätningar och bildplanimetrisk analys i gnagarevävnader och kan vara av värde för allmän vetenskaplig makrofotografering. Dessutom tillåter bildernas höga kvalitet och konsistens att automatiserad analys av digitala fotografier utförs, vilket hjälper till att spara tid, undvika användarinmatning och minimera risken för fel eller partiskhet under bildanalys. Detta kommer att resultera i generering av robusta och tillförlitliga data och öka översättningen av prekliniska upptäckter till nya antiischemiska behandlingar på kliniker.
Beredning av hjärtat efter IR börjar med reocclusion av blodhjärtartärer och perfusion av blått färgämne för diskriminering av riskområden från icke-riskområden. Metylenblå eller Evans blå färgämnen används oftast för detta ändamål2. Eftersom ett alltför högt tryck kan skada hjärtklaffarna och därmed delvis eller helt fläcka riskområden, är det bättre att perfusera hjärtat med ett tryckstyrt system, såsom Langendorff-apparaten eller en förenklad version av en hydrostatisk trycksystemutrustad spruta eller pump. Kontrollerad perfusion kommer att säkerställa fysiologiskt tryck, och färgämnet kommer vanligtvis inte in i hjärtats ockluderade region. Både flödeshastighets- och tryckstyrda tekniker är skydd mot överhållande.
Ett av de allvarligaste misstagen i livskraftig vävnadsbehandling är att hålla vävnader i en frys under en längre tid före färgning. Frysning används främst för att forskare vill utföra hjärtfärgning dagen efter IR-experimentet eller senare. Dessutom används frysning för att göra skärningen av hjärtat enklare. Vi fann att kortvarig frysning av hjärtat i upp till 5-10 minuter försumbart påverkar hjärtvävnadernas integritet och underlättar skärning av vävnaderna (särskilt för mushjärtan) i tunna skivor. Frysning under längre perioder skadar dock membranen och minskar cellviabiliteten och mitokondriell funktion13. Som ett resultat påverkas TTC-färgning av fungerande mitokondrier, och gränsen mellan nekrotiska och livskraftiga vävnader är dåligt avgränsad (suddig). Sammantaget bör frysning av råtthartar undvikas, och endast kortvarig frysning av mushjärtan kan användas för enklare skärning.
Nästa steg är vävnadsfärgning i 1% TTC-lösning vid 37 °C14. Färgningslösningen bör förvärras – särskilt viktigt för färgning av hjärnskivor. Vid användning av den förvärmde lösningen är den optimala färgningstiden för hjärtskivor 10 min. En längre inkubation eller en temperatur högre än 37 ° C resulterar i brunfärgning av hjärtvävnaderna. Korrekt färgning av prover och konsekvent röd färgintensitet är viktiga för vidare bildanalys. I de sista stegen före fotografering sköljs vävnadsskivorna 2-3 gånger med kall PBS eller en liknande buffert för att avlägsna TTC och överskott av metylenblått från lösningen för att undvika blå gjutning på fotografiet. Hjärtskivor bör fotograferas strax efter färgning för att få bästa bildkvalitet. Hjärtfärgning förblir av god kvalitet om den förvaras i upp till 60 minuter i den kalla (+4 ° C) PBS. Färgade hjärnskivor och aortavävnader lagras vanligtvis i en 4% neutral formaldehydlösning och behåller god kvalitet i en vecka. Nattlig lagring av hjärnvävnader i formalin (+4 °C) försämrar inte färgintensiteten hos normal vävnad och är godtagbar för bildförvärv. Formalin inducerar emellertid svullnad och kvarhållande av hjärtskivor. Därför rekommenderas inte lagring av hjärtvävnader i formalin.
Nästa steg är bildförvärv. Många laboratorier använder flatbäddsskannrar som ett bildinsamlingsverktyg som förväntas ersätta en digitalkamera och belysningsinställning. Vi bestämde oss för att skanning av skivor inte ger tillräcklig bildupplösning och färgseparation och därför inte är lämplig för avbildning av hjärtskivor. I synnerhet är skannerupplösningen otillräcklig för mushjärtan, och vi märkte dålig återgivning av metylenblått. Däremot kan en skanner vara ett alternativ till en fotokamera för avbildning av hjärnskivor färgade endast med TTC eller andra enskilda färgämnen. För skanning av vävnadsskivor är skanningsprogramvara som säkerställer konstanta exponeringsinställningar avgörande. Sammantaget är en flatbäddsskanner mindre kapabel och kan inte ersätta en digitalkamera för de flesta bildapplikationer.
Bakgrunden bakom exemplar är också viktig. Helst bör brickans botten vara av en färg som inte finns i det färgade provet. Till exempel, för att kvantifiera området för metylenblå och TTC (röd) färgning på ett automatiserat eller halvautomatiskt sätt, bör vita, röda, blå, gula och bruna bakgrunder undvikas. Således skulle en grön bakgrund vara att föredra. Ändå beror färgvalet på operatörens preferenser, som efterbehandlar bilden. Många forskare föredrar en vit bakgrund eftersom en vit bakgrund kan raderas i bildbehandling och konverteras till helt vit (RGB vit kod 255,255,255). Då bör man utesluta helt vitt från listan över valda färger som används för halvautomatisk analys och bara räkna bleka nekrotiska områden, som inte är helt vita om de inte är överexponerade. Blå och gröna bakgrunder är lämpliga för fotografering av hjärnskivor och aortor.
Det optimala bildverktyget för vävnadsfotografering är en enlinsreflex eller spegelfri digitalkamera med utbytbart objektiv med en kompatibel makrolins. Att fånga mycket små objekt kan kräva en kombination av en kamera och ett mikroskop; Ändå har en makrolins vanligtvis tillräcklig (minst 1: 2) förstoring för att få detaljerade bilder av ett mushjärta. Många tillverkare erbjuder prisvärda digitalkameror och makrolinser för att få högupplösta och högupplösta fotografier. Alla uppdaterade digitalkameror har egenskaper och funktioner som är nödvändiga för makrofotografering, inklusive möjligheten att montera på ett stativ, ett stort antal pixlar (vanligtvis >20 Mpx), livevisning, spegellåsning, time-lapse-funktioner, fjärrslutare och möjligheten att manuellt ställa in kameraparametrar, vilket säkerställer en konstant slutartid, bländare, vitbalans och ISO-inställning. Kompaktkameror med ovan nämnda funktioner och objektivförstoring på minst 1:2 kan också användas för makrofotografering. På grund av linsens egenskaper bör vissa kompaktkameror placeras i närheten av objektet, och experimenteraren måste se till att kamerahuset inte påverkar provets belysning.
För makrofotografering med alla typer av utbytbara objektivkameror krävs en makrolins med hög förstoring (1:1-1:2). Vi föreslår att du använder makroobjektiv med en brännvidd från 50 mm till 100 (120) mm eller motsvarande på fullformatssensorn (24 mm x 36 mm). Mindre sensorkameror har olika sensorstorlekar, och förstoringen bör räknas om i enlighet därefter. För fotografering av hjärtskivor är ett ergonomiskt avstånd mellan 100 mm makrolinsens främre element till motivet cirka 150 mm. Med den här inställningen kan operatörerna ha all utrustning på ett bord, med enkel åtkomst till kamerakontrollerna. En 50 mm makrolins kan övervägas för fotografering av större objekt, såsom hjärnskivor, eftersom ett bredare synfält är nödvändigt för att få alla skivor i ett enda fotografi.
För att få skarpa bilder med hög upplösning bör en kamera monteras på ett robust stativ, som tillsammans med en ljusinställning kallas ett fotokopieringsstativ. Att montera kameran på ett stativ och en fjärrkontroll (trådbunden eller trådlös) utlösare eliminerar kameraskakningar och säkerställer ett konstant avstånd från målet. En kamerabelysningsinställning med två konstanta ljuskällor från båda sidor, vinklade cirka 30-60 ° i förhållande till motivplanet, säkerställer tillräcklig belysning av prover och hjälper till att undvika reflektioner samtidigt. Kameran ska monteras exakt så att sensorn är parallell med motivplanet. För att jämnt belysa bildfältet bör båda lamporna vara lika orienterade och placerade på samma avstånd från motivet. Ljuskällor placerade på olika avstånd från motivet orsakar ojämn belysning. Dessutom är blinkande ljuskällor en orsak till variationer i bildexponering. Sammantaget är det viktigt att placera kameran och ljuskällorna exakt för att exakt få bilder av väl upplysta exemplar.
Vävnadsprover reflekterar ljus (glisten), som visas som vita fläckar i bilderna. Dessa ljusreflektionsfläckar innehåller inte användbar färginformation, och följaktligen kan dessa delar av bilderna inte användas för noggrann kvantitativ analys av bilder. Ljusreflektioner från vävnadsskivor kan avlägsnas med olika metoder. Den mest effektiva är fullständig nedsänkning av vävnadsprover i en behållare med en saltlösning eller PBS-lösning. Ett liknande tillvägagångssätt är införandet av vävnadsskivor under (eller mellan) glasplattor. Denna metod är effektiv mot reflektioner; Bildupplösningen kan dock vara lägre än för fotografier av nedsänkta vävnader.
Man kan också använda ett polariserande filter monterat på en lins för att eliminera ljusreflektioner. Cirkulära polariserande filter är allmänt tillgängliga men varierar avsevärt i kvalitet beroende på pris, och billiga filter kan avsevärt minska bildupplösningen. Reflekterat ljus kan filtreras bort genom att vrida den rörliga delen av polariseringsfiltret i en vinkel. Effekten av polariseringsfiltret kan påverkas av vissa ljuskällor (t.ex. starkt LED-ljus). Sammantaget, efter avlägsnande av extra vätska, kan ett polariserande filter eliminera alla reflektioner från hjärnskivorna; Provnedsänkning i buffertlösning är dock det enklaste och mest kostnadseffektiva tillvägagångssättet för hjärtskivor.
Manuella inställningar för slutartid, bländare, ISO och vitbalans är viktiga för att behålla full kontroll över bildprocessen. Ljuskällans prov, bakgrund och egenskaper påverkar kamerans exponeringsmätningssystem i automatiska inställningar. Därför är manuella inställningar nödvändiga för att upprätthålla konstant exponering och vitbalans mellan flera fotografier under experimentet. För makrofotografering är den föreslagna bländarinställningen mellan f/8 och f/16. Genom att minska bländaren ökar skärpedjupet, vilket är till hjälp om objektet inte består av ett enda plan. Diffraktion begränsar dock den totala upplösningen av fotografering vid mindre bländare. Den optimala bländaren för de flesta objektiv är vanligtvis f/10 eftersom upplösningsfallet i denna inställning är försumbart och skärpedjupet är tillräckligt. ISO-värden som sträcker sig från 50 till 400 (lägre är bättre) är vanligtvis optimala för att minimera bildartefakter (brus). Slutartiden återstår sedan att ändra för att få korrekt exponering med hjälp av de nämnda bländar- och ISO-inställningarna under befintliga ljusförhållanden. Manuella inställningar är viktiga för konsekvent bildanalys. Standardiserad avbildning säkerställer användningen av samma färgtröskelinställningar i alla studier, vilket kräver segmenteringsanalys. Till exempel kan halvautomatisk analys av ImagePro-programvara baserad på en segmenteringsfil med fördefinierade färger av blått, rött och vitt (+ blekrosa) användas genom åren om provbilder har konsekventa färger, vitbalans och exponering.
Vitbalansinställningen bör justeras beroende på färgtemperaturen för ljuskällan som används för att belysa ett prov. Vitbalans kan väljas från kamerans inbyggda förinställningar eller med manuell kalibrering av ett grått mål. Fördelen med bildtagning i RAW-format är att vitbalansen kan justeras under efterbehandling av bilden. Eftersom RAW-filer innehåller mycket mer information än JPEG-filer, ger RAW-fil efterbehandling ett utmärkt tillfälle för korrigering av färgbalans och exponering, samt för att få bättre bildupplösning. Eftersom de flesta kameror kan fånga JPEG- och RAW-filer samtidigt föreslår vi att du tar RAW-filen och sparar den som en säkerhetskopia.
Sammantaget beskriver detta protokoll en metod för skivning och färgning av råtthjärta och hjärnvävnad och ger riktlinjer för att fastställa belysnings- och kamerainställningar och fotograferingstekniker för högupplöst bildförvärv för vidare analys. Denna metod är tillämplig på all experimentell smådjursorganfotografering.
The authors have nothing to disclose.
Författarna fick stöd av EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 enligt bidragsavtal nr 857394, Projekt FAT4BRAIN.
1 mL syringe | Sagimed | N/A | |
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
5 mL syringe | Sagimed | N/A | |
50 mL syringe | Terumo | N/A | |
Adult Rat Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSRAS001-1 | |
Aortic cannula for mouse heart | ADInstruments | SP3787 | |
Aortic cannula for rat heart | ADInstruments | SP3786 | |
Calcium chloride dihydrate, ≥99% | Acros Organics | 207780010 | |
Cover Glass Forceps, Angled | Fine Science Tools | 11073-10 | |
Hemostatic forceps | Agnthos | 13008-12 | |
Hoya 62 mm alpha Circular Polarizer Filter | Hoya | HOCPA62 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Penta | 16330-31000 | |
Methylene Blue | SigmaAldrich | M9140 | |
Mouse Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSMS005-1 | |
Polyethylene plastic tubing | BD Intramedic | N/A | |
Potassium chloride for biochemistry | Acros Organics | 418205000 | |
Potassium phosphate, monobasic, ≥99% | Acros Organics | 205920025 | |
Rat Heart Slicer Matrix | Zivic Instruments | HSRS001-1 | |
Scissors curved with blunt ends | Agnthos | 14013-15 | |
Scissors for cleaning heart | Agnthos | 14058-11 | |
Single Edge Razor Blades | Zivic Instruments | BLADE012.1 | |
Sodium bicarbonate for biochemistry, 99.5% | Acros Organics | 447100010 | |
Sodium chloride | Fisher bioreagents | BP358-10 | |
Sony Alpha a6000 Mirrorless Digital Camera | Sony | ILCE6000 | Can be repalaced by any up-to-date digiatal camera |
Sony FE 90 mm F/ 2.8 Macro G OSS | Sony | SEL90M28G | Important, lens should be compatible with camera |
Sony SF32UZ SDHC 32 GB Class 10 UHS | Sony | 2190246141 | |
Surgical blade | Heinz Herenz Hamburg Germany | BS2982 | |
Thermo-Shaker | BioSan | PST-60HL-4 | |
Toothed tissue forceps | Agnthos | 11021-12 | |
Toothed tissue forceps for cleaning heart | Agnthos | 11023-10 | |
Weigh tray, 70 mL | Sarsted | 71,99,23,212 |