Multiplex in situ hybridisering (ISH) ble brukt til samtidig å visualisere transkripsjonene for to G protein-koblede reseptorer og en transkripsjonsfaktor i hele vagal ganglionic komplekset av den voksne musen. Denne protokollen kan brukes til å generere nøyaktige kart over transkripsjonsprofilene til vagal afferent nevroner.
Denne studien beskriver en protokoll for multiplex in situ hybridisering (ISH) av musen jugular-nodose ganglia, med særlig vekt på å oppdage uttrykket av G protein-koblede reseptorer (GPCRs). Formalin-fast jugular-nodose ganglia ble behandlet med RNAscope-teknologien for samtidig å oppdage uttrykket av to representative GPCRs (cholecystokinin og ghrelinreseptorer) i kombinasjon med ett markørgen av enten nodose (parret-lignende homeobox 2b, Phox2b) eller jugular afferent neuroner (PR-domene sink finger protein 12, Prdm12). Merket ganglia ble avbildet ved hjelp av konfokal mikroskopi for å bestemme fordelings- og uttrykksmønstrene til de nevnte transkripsjonene. Kort sagt, Phox2b afferent nevroner ble funnet å rikelig uttrykke cholecystokinin reseptoren (Cck1r), men ikke ghrelin reseptoren (Ghsr). En liten undergruppe av Prdm12 afferent neuroner ble også funnet å uttrykke Ghsr og / eller Cck1r. Potensielle tekniske advarsler i design, behandling og tolkning av multiplex ISH diskuteres. Tilnærmingen beskrevet i denne artikkelen kan hjelpe forskere med å generere nøyaktige kart over transkripsjonsprofilene til vagal afferent nevroner.
Cellelegemene til vagal afferents finnes i jugular, petrosal og nodose ganglia1,2,3. Deres axoner reiser sammen via flere grener av vagusnerven til kraniocervical, thoracic og abdominal territorier4,5,6,7. Fra deres viscerale avslutninger kan vagal afferents reagere på et bredt spekter av fysiologiske og skadelige stimuli8,9,10. Fordelingen av signalmolekyler og reseptorer involvert i vagal sensing er imidlertid fortsatt dårlig karakterisert. Dette skyldes delvis at vagal ganglia, til tross for sin lille størrelse, uttrykker et bredt spekter av reseptorer, inkludert et stort antall GPCRs8,11,12,13. Videre er vagal afferent nevroner iboende heterogene og viser distinkte molekylære profiler14. For å komplisere saken er jugularet, petrosal og nodose ganglia festet i musen, og danner dermed en enkelt gangionisk masse. Til slutt, i en undergruppe av dyr, er nodose ganglion festet til den sympatiske overlegne Cervical ganglion15.
Tidligere har etterforskere vendt seg til immunhiistokjemi for å studere den nevrokjemiske sminken av vagal afferent nevroner16,17,18. Mens immunhiistokjemi ved hjelp av validerte antistoffer er nyttig, må resultatene av immunhiistokjemiske studier tolkes med forsiktighet. For eksempel har mange anstrengelser for å identifisere spesifikke antistoffer mot GPCRs mislyktes19,20,21,22,23,24,25, noe som fører til at etterforskere konkluderer med at flertallet av antistoffer mot GPCRs er upålitelige. For å omgå disse problemene har kvantitativ PCR (qPCR) blitt mye brukt til å vurdere genuttrykk i gnager vagal ganglionic mass26,27,28,29. Imidlertid skjer undersøkelse av genuttrykk ved hjelp av qPCR på bekostning av tap av romlig informasjon. Spesielt kan det ikke forutsies hvor mange celler eller hvilke celletyper som uttrykker et bestemt gen av interesse (f.eks. nodose vs. jugularceller). Tilbakevendende problemer inkluderer også forurensning med tilstøtende vev og inkludering av variable lengder av vagusnerven, overlegen cervical og jugular ganglia under disseksjon15. Som et resultat av de ovennevnte vanskelighetene omgir kontroverser uttrykket og distribusjonen av flere GPCRs i vagal afferent nevroner. Et spesielt forvirrende eksempel er ghrelinreseptoren (Ghsr). Mens noen studier har funnet utbredt uttrykk for denne reseptoren i vagal afferent nevroner30,31,32, andre har funnet Ghsr mRNA å være nesten uoppdagelig i nodose ganglion11,14. Detaljert kartlegging av Ghsr mRNA i vagal ganglionic mass er derfor berettiget.
In situ hybridisering (ISH) har også blitt brukt til å vurdere genuttrykksmønstre i vagal ganglionic mass7,11,12,33,34,35. Fordi RNA-baserte teknikker forblir mer pålitelige og spesifikke enn antistoffbaserte teknikker under de fleste omstendigheter36,37, har ISH-studier vist seg verdifulle for bedre forståelse av nevrokjemisk koding av vagal afferent nevroner. Likevel er tradisjonelle ISH-teknikker i seg selv ikke uten forbehold. Radioaktiv ISH er følsom, men genererer bakgrunn og forblir tungvint38. Ikke-radioaktiv ISH er mindre komplisert, men også mindre følsom38. Derimot er den nylig utviklede RNAscope ISH-metoden svært følsom og genererer minimal bakgrunn39. Den nåværende studien anvendte multipleks fluorescerende RNAscope til påvisning av GPCRs i vagal afferent neuroner av musen. Vi fokuserte på å kartlegge fordelingen av Ghsr og sammenlignet distribusjonen med kolecystokininreseptoren (Cck1r), en annen GPCR kjent for å bli uttrykt i nodose ganglion34. Til slutt ble de to transkripsjonsfaktorene, parret-lignende homeobox 2b (Phox2b) og PR-domene sinkfingerprotein 12 (Prdm12), brukt som selektive markører for henholdsvis nodose og jugular afferent neuroner, henholdsvis14. Uten å visualisere Phox2b eller Prdm12, ville det være utfordrende å identifisere jugular vs. nodose afferents med sikkerhet. Potensielle tekniske fallgruver diskuteres også gjennom hele artikkelen.
Teknikken til ISH ble oppfunnet på slutten av 1960-tallet42. Det er imidlertid ikke før på midten av 1980-tallet at det ble brukt til påvisning av mRNAer i de sentrale og perifere nervesystemene43,44. Tatt i betraktning nervesystemets heterogenitet og tilbakevendende problemer med antistoffer, er lokalisering av en bestemt transkripsjon på cellenivå fortsatt et uvurderlig verktøy. Likevel har tradisjonelle ISH-metoder forblitt arbei…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core finansiert av NIH grant #5P01DK119130-02. Forfatterne ønsker å anerkjenne hjelpen fra UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (ledet av Dr. Phelps) og dets ansatte (Abhijit Bugde og Marcel Mettlen), delvis støttet av NIH Grant #1S10OD021684-01, en delt ressurs for Harold C. Simmons Cancer Center, støttet delvis av et NCI Cancer Center Support Grant, P30 CA142543.
10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
-80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
HybEZ oven | hybridization oven | ||
Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
ImageJ-Fiji | NIH | ||
Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
User manual | ACD | 323100 USM | |
Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
ZEN Imaging Software | Zeiss |