Den raffinerade svansvenstranssektionstranssektionsmodellen (TVT) hos sövda möss är en känslig in vivo-metod för bedömning av hemofil blödning. Denna optimerade TVT-blödningsmodell använder blodförlust och blödningstid som slutpunkter, förfinar andra modeller och undviker döden som slutpunkt.
Svansblödningsmodeller är viktiga verktyg inom hemofiliforskning, speciellt för bedömning av prokoagulerande effekter. Överlevnadsmodellen för svansvenstranssektion (TVT) har föredragits i många miljöer på grund av känslighet för kliniskt relevanta doser av FVIII, medan andra etablerade modeller, såsom svansklämmodellen, kräver högre nivåer av prokoagulerande föreningar. För att undvika att använda överlevnad som slutpunkt utvecklade vi en TVT-modell som fastställde blodförlust och blödningstid som slutpunkter och full anestesi under hela experimentet. I korthet placeras bedövade möss med svansen nedsänkt i tempererad saltlösning (37 ° C) och doseras med testföreningen i den högra laterala svansvenen. Efter 5 minuter transekteras den vänstra laterala svansvenen med hjälp av en mallguide, svansen återförs till saltlösningen och alla blödningsepisoder övervakas och registreras i 40 minuter medan blodet samlas in. Om ingen blödning inträffar vid 10 min, 20 min eller 30 min efter skada, utmanas blodproppen försiktigt genom att torka av snittet två gånger med en våt gasbinda. Efter 40 minuter kvantifieras blodförlusten av mängden hemoglobin som blöder in i saltlösningen. Denna snabba och relativt enkla procedur resulterar i konsekventa och reproducerbara blödningar. Jämfört med TVT-överlevnadsmodellen använder den ett mer humant förfarande utan att kompromissa med känsligheten för farmakologisk intervention. Dessutom är det möjligt att använda båda könen, vilket minskar det totala antalet djur som behöver födas upp, i enlighet med principerna för 3R: er. En potentiell begränsning i blödningsmodeller är hemostasens stokastiska natur, vilket kan minska modellens reproducerbarhet. För att motverka detta säkerställer manuell proppstörning att blodproppen utmanas under övervakningen, vilket förhindrar primär (trombocyt) hemostas från att stoppa blödningen. Detta tillägg till katalogen över blödningsskademodeller ger möjlighet att karakterisera prokoagulerande effekter på ett standardiserat och humant sätt.
Djurmodeller är viktiga för att förstå patogenesen av hemofili och utveckla och testa behandlingsregimer och terapier. Faktor VIII knock-out mus (F8-KO) är en allmänt använd modell för studier av hemofili A 1,2. Dessa möss rekapitulerar viktiga egenskaper hos sjukdomen och har använts i stor utsträckning för utveckling av behandlingar, såsom rekombinanta FVIII-produkter 3,4,5 och genterapistrategier 6,7.
Det finns olika blödningsskademodeller för att utvärdera de farmakologiska effekterna av olika hemostatiska föreningar in vivo. En av dessa koagulationsmodeller är överlevnadsmodellen för svansventranssektion hos möss 8,9,10,11,12,13,14, som mäter förmågan hos hemofila möss att överleva exsanguination efter svanstranssektion. Denna metod introducerades för mer än fyra decennier sedan15 och används fortfarande 9,16,17. Modellen använder dock överlevnad som slutpunkt och kräver observation av djuren under en period på upp till 24 timmar, under vilken djuren är medvetna och därmed kan uppleva smärta och nöd.
Blödningsmodeller med kortare varaktighet och under full anestesi har beskrivits tidigare, såsom svansklämmodellen (även känd som svansspetsen)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . För en fullständig normalisering av blodförlust efter blödningsutmaningen kräver dessa modeller dock doser av prokoagulerande föreningar (t.ex. FVIII) mycket högre än de som administreras kliniskt29. En annan skademodell under anestesi, vena saphena-blödningsmetoden, är känslig för lägre doser av prokoagulerande föreningar30 men kräver en hög nivå av experimentintervention eftersom blodpropparna måste störas ofta (i motsats till 3 gånger i den presenterade modellen).
Standardisering mot ett gemensamt protokoll för att testa nya prokoagulerande föreningar skulle i hög grad underlätta datajämförelse mellan laboratorier 31,32,33. I TVT-modeller finns det ännu ingen gemensam överenskommelse om studerade effektmått (blodförlust 7,26, blödningstid 9,34 och överlevnad 35,36), och experimentell längd varierar mellan studier13.
Vårt primära mål är att beskriva och karakterisera en optimerad modell med hög reproducerbarhet, möjligheten att studera on-demand såväl som en profylaktisk behandling, känslighet för farmakologisk intervention motsvarande överlevnadsmodellen, men ändå inte använda död eller nära-död som endpoints. För att minska smärta och ångest bör djuren inte vara vid medvetande vid avblodning och ett mer etiskt effektmått behöver implementeras37.
Svansklämmodeller utförs vanligtvis i en av två varianter, antingen amputerar svansspetsen, t.ex. amputation av 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 eller, i en svårare variant, transekterad med en svansdiameter runt 1-3 mm 8,22,25 . Detta orsakar en kombinerad arteriovenös blödning, eftersom laterala och dorsala vener och ventral artär vanligtvis är avskurna, och i allmänhet, ju större amputationen är, desto lägre är känsligheten för en prokoagulerande förening. Dessutom, eftersom svansspetsen amputeras, exponeras den arteriovenösa skadan utan någon motsatt vävnad; således, åtminstone i teorin, är det olikt de vanligaste hemofila blödningarna.
Som namnet antyder skadas endast venen i svansvenens transsektionsmodeller som beskrivs i detta papper, vilket resulterar i en uteslutande venös blödning. Eftersom kärlet inte är helt avskuret förväntas skadan vara mindre än i amputationsmodellerna, och vävnaden runt snittet, som en blodpropp kan fästa vid, behålls. Dessutom finns det lägre blodtryck i venen i motsats till artären. Dessa faktorer bidrar till en ökad känslighet i förhållande till amputationsmodeller, så att normalisering av blödning kan uppnås med kliniskt relevanta doser av substitutionsbehandling, t.ex. med rFVIII vid hemofili A, vilket är användbart för att utvärdera storleken och hållbarheten av effekterna av prokoagulantiabehandling 26,38,39.
Denna optimerade metod för svansvenstranssektion (TVT) har flera fördelar jämfört med TVT-överlevnadsmetoden. Djuren är helt sövda under hela studietiden, vilket underlättar mushanteringen och ökar djurens välbefinnande. Vidare, till skillnad från TVT-överlevnadsmodellen, krävs inte observation över natten, och denna optimerade modell erbjuder möjligheten att mäta blodförlust och observera den exakta blödningstiden över 40 minuter. Längre blödningsperioder hos medvetna djur kan också orsaka dödsfal…
The authors have nothing to disclose.
Esther Bloem och Thomas Nygaard är erkända för stöd med mätningar av FVIII i plasma. Bo Alsted är erkänd för att ha ritat och bearbetat mallen och skärblocken.
#11 Scalpel blade | Swann-Morton | 503 | |
15 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One, Austria | 188271 | |
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing | BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe | 320830 | |
Advate | Takeda, Japan | Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII) | |
Alcohol pads 70% ethanol | Hartmann, Soft-Zellin | 999 979 | |
Centrifuge | Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech | ||
Cutting template (Stainless steel) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm | |
Erythrocytes (RBC) lysing solution | Lysebio, ABX Diagnostics | 906012 | |
Gauze | |||
Haematological analyser | Sysmex | CT-2000iv | |
Heating lamp on stand | Phillips | IR250 | |
Heating pad with thermostat | CMA | model 150 | |
Hemoglobin standards and controls – 8.81 mmol / l batch dependent | HemoCue, Denmark | HemoCue calibrator, 707037 | Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH). |
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box | Sigma Delta Dameca | ||
Isoflurane | Baxter | 26675-46-7 | |
Magnifier with lights | Eschenbach | ||
Measuring template (Aluminum) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm | |
Micropipettes + tips | Finnpipette | ||
Photometer | Molecular Devices Corporation, CA, USA | SpectraMax 340 photometer | |
Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | Version 9.0.1 | |
Saline 0.9% NaCl | Fresenius Kabi, Sweden | 883264 | |
Special tail marker block for TVT tail cut | |||
Tail holder | |||
Vacuum liquid suction | Vacusafe comfort, IBS | ||
Waterbath and thermostat | TYP 3/8 Julabo |