نموذج نزيف نقل الوريد الذيل المكرر (TVT) في الفئران المخدرة هو طريقة حساسة في الجسم الحي لتقييم نزيف الهيموفيليا. يستخدم نموذج نزيف TVT المحسن هذا فقدان الدم ووقت النزيف كنقاط نهاية ، مما يؤدي إلى تحسين النماذج الأخرى وتجنب الموت كنقطة نهاية.
نماذج نزيف الذيل هي أدوات مهمة في أبحاث الهيموفيليا ، وتحديدا لتقييم آثار التخثر. تم تفضيل نموذج البقاء على قيد الحياة لانتقال الوريد الذيل (TVT) في العديد من الإعدادات بسبب الحساسية للجرعات ذات الصلة سريريا من الثامن ، في حين أن النماذج الأخرى المعمول بها ، مثل نموذج مشبك الذيل ، تتطلب مستويات أعلى من مركبات التخثر. لتجنب استخدام البقاء على قيد الحياة كنقطة نهاية ، قمنا بتطوير نموذج TVT يحدد فقدان الدم ووقت النزيف كنقاط نهاية وتخدير كامل خلال التجربة بأكملها. باختصار ، يتم وضع الفئران المخدرة مع الذيل المغمور في محلول ملحي معتدل (37 درجة مئوية) وجرعات مع مركب الاختبار في الوريد الجانبي الأيمن للذيل. بعد 5 دقائق ، يتم نقل وريد الذيل الجانبي الأيسر باستخدام دليل قالب ، ويتم إرجاع الذيل إلى محلول ملحي ، ويتم مراقبة جميع نوبات النزيف وتسجيلها لمدة 40 دقيقة أثناء جمع الدم. إذا لم يحدث أي نزيف في 10 دقائق أو 20 دقيقة أو 30 دقيقة بعد الإصابة ، يتم تحدي الجلطة بلطف عن طريق مسح القطع مرتين باستخدام قطعة شاش مبللة. بعد 40 دقيقة ، يتم قياس فقدان الدم كميا بكمية الهيموغلوبين التي تنزف في المياه المالحة. ينتج عن هذا الإجراء السريع والبسيط نسبيا نزيف ثابت وقابل للتكرار. بالمقارنة مع نموذج البقاء على قيد الحياة TVT ، فإنه يستخدم إجراء أكثر إنسانية دون المساس بالحساسية للتدخل الدوائي. علاوة على ذلك ، من الممكن استخدام كلا الجنسين ، مما يقلل من العدد الإجمالي للحيوانات التي تحتاج إلى تربية ، وفقا لمبادئ 3R. أحد القيود المحتملة في نماذج النزيف هو الطبيعة العشوائية للإرقاء ، والتي يمكن أن تقلل من قابلية تكرار النموذج. ولمواجهة ذلك، يضمن تعطيل الجلطة اليدوي تحدي الجلطة أثناء المراقبة، مما يمنع الإرقاء الأولي (الصفائح الدموية) من وقف النزيف. توفر هذه الإضافة إلى كتالوج نماذج إصابات النزيف خيارا لتوصيف تأثيرات التخثر بطريقة موحدة وإنسانية.
النماذج الحيوانية ضرورية لفهم التسبب في الهيموفيليا وتطوير واختبار أنظمة العلاج والعلاجات. فأر العامل الثامن بالضربة القاضية (F8-KO) هو نموذج يستخدم على نطاق واسع لدراسة الهيموفيليا A 1,2. تلخص هذه الفئران السمات الرئيسية للمرض وقد استخدمت على نطاق واسع لتطوير العلاجات ، مثل منتجات FVIII المؤتلفة3،4،5 واستراتيجيات العلاج الجيني6،7.
هناك العديد من نماذج إصابات النزيف لتقييم الآثار الدوائية لمركبات مرقئ مختلفة في الجسم الحي. أحد نماذج التخثر هذه هو نموذج البقاء على قيد الحياة في نقل الوريد الذيل في الفئران 8,9,10,11,12,13,14 ، مما يقيس قدرة الفئران المحبة للهيموفيليا على البقاء على قيد الحياة بعد نقل الذيل. تم تقديم هذه الطريقة منذ أكثر من أربعة عقودمنذ 15 عاما ولا تزال تستخدم9،16،17. ومع ذلك ، يستخدم النموذج البقاء على قيد الحياة كنقطة نهاية ويتطلب مراقبة الحيوانات على مدى فترة تصل إلى 24 ساعة ، تكون خلالها الحيوانات واعية وبالتالي يمكن أن تعاني من الألم والضيق.
تم وصف نماذج النزيف ذات المدة الأقصر وتحت التخدير الكامل سابقا ، مثل نموذج مشبك الذيل (المعروف أيضا باسم طرف الذيل)8،18،19،20،21،22،23،24،25،26،27،28 . ومع ذلك ، من أجل تطبيع كامل لفقدان الدم بعد تحدي النزيف ، تتطلب هذه النماذج جرعات من مركبات التخثر (على سبيل المثال ، FVIII) أعلى بكثير من تلك التي تدار سريريا29. نموذج إصابة مختلف تحت التخدير ، طريقة نزيف الوريد سافينا ، حساس لجرعات أقل من مركبات التخثر30 ولكنه يتطلب مستوى عاليا من تدخل المجرب حيث يجب تعطيل الجلطات بشكل متكرر (على عكس 3 مرات في النموذج المعروض).
ومن شأن التوحيد القياسي نحو بروتوكول مشترك لاختبار مركبات جديدة مسببة للتخثر أن يسهل إلى حد كبير مقارنة البيانات بين المختبرات 31،32،33. في نماذج TVT ، لا يوجد حتى الآن اتفاق مشترك على نقاط النهاية المدروسة (فقدان الدم 7,26 ، وقت النزيف 9,34 ، ومعدل البقاء على قيد الحياة 35,36) ، ويختلف الطول التجريبي بين الدراسات13.
هدفنا الأساسي هو وصف وتوصيف نموذج محسن مع قابلية عالية للتكرار ، وإمكانية الدراسة عند الطلب بالإضافة إلى العلاج الوقائي ، والحساسية للتدخل الدوائي المكافئ لنموذج البقاء على قيد الحياة ، ولكن لا تستخدم الموت أو الاقتراب من الموت كنقاط نهاية. من أجل الحد من الألم والضيق ، يجب ألا تكون الحيوانات واعية أثناء النزيف ويجب تنفيذ نقطة نهاية أكثر أخلاقية37.
يتم إجراء نماذج مشبك الذيل بشكل عام في أحد الخيارين ، إما بتر طرف الذيل ، على سبيل المثال ، بتر 1-5 مم18،19،20،21،23،24 أو ، في متغير أكثر شدة ، يتم نقله بقطر ذيل حوالي 1-3 مم8،22،25 . هذا يسبب نزيفا شريانيا وريديا مشتركا ، حيث يتم عادة قطع الأوردة الجانبية والظهرية والشريان البطني ، وبشكل عام ، كلما زاد البتر ، انخفضت الحساسية لمركب التخثر. علاوة على ذلك ، نظرا لأن طرف الذيل مبتور ، فإن الإصابة الشريانية الوريدية مكشوفة دون أي أنسجة متعارضة. وبالتالي ، على الأقل من الناحية النظرية ، فإنه يختلف عن نزيف الهيموفيليا الأكثر شيوعا.
كما يوحي الاسم ، يصاب الوريد فقط في نماذج نقل الوريد الذيل كما هو موضح في هذه الورقة ، مما يؤدي إلى نزيف وريدي حصري. نظرا لأن الوعاء غير مقطوع بالكامل ، فمن المتوقع أن تكون الإصابة أصغر مما كانت عليه في نماذج البتر ، ويتم الاحتفاظ بالأنسجة المحيطة بالقطع ، والتي قد تلتصق بها الجلطة. بالإضافة إلى ذلك ، هناك انخفاض في ضغط الدم في الوريد بدلا من الشريان. تساهم هذه العوامل في زيادة الحساسية بالنسبة لنماذج البتر ، بحيث يمكن تحقيق تطبيع النزيف بجرعات ذات صلة سريريا من العلاج البديل ، على سبيل المثال ، مع rFVIII في الهيموفيليا A ، وهو أمر مفيد لتقييم حجم ومتانة آثار العلاج بالتخثر26،38،39.
هذه الطريقة المحسنة لنقل الوريد الذيل (TVT) لها العديد من المزايا مقارنة بطريقة البقاء على قيد الحياة TVT. يتم تخدير الحيوانات بالكامل طوال مدة الدراسة ، مما يجعل التعامل مع الفئران أسهل ويزيد من رفاهية الحيوان. علاوة على ذلك ، على عكس نموذج البقاء على قيد الحياة TVT ، فإن المراقبة بين عشية وضحا…
The authors have nothing to disclose.
تم الاعتراف بإستر بلوم وتوماس نيغارد لدعمهما في قياسات FVIII في البلازما. يتم التعرف على بو ألستيد لرسم وتصنيع القالب وقطع الكتل.
#11 Scalpel blade | Swann-Morton | 503 | |
15 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One, Austria | 188271 | |
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing | BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe | 320830 | |
Advate | Takeda, Japan | Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII) | |
Alcohol pads 70% ethanol | Hartmann, Soft-Zellin | 999 979 | |
Centrifuge | Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech | ||
Cutting template (Stainless steel) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm | |
Erythrocytes (RBC) lysing solution | Lysebio, ABX Diagnostics | 906012 | |
Gauze | |||
Haematological analyser | Sysmex | CT-2000iv | |
Heating lamp on stand | Phillips | IR250 | |
Heating pad with thermostat | CMA | model 150 | |
Hemoglobin standards and controls – 8.81 mmol / l batch dependent | HemoCue, Denmark | HemoCue calibrator, 707037 | Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH). |
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box | Sigma Delta Dameca | ||
Isoflurane | Baxter | 26675-46-7 | |
Magnifier with lights | Eschenbach | ||
Measuring template (Aluminum) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm | |
Micropipettes + tips | Finnpipette | ||
Photometer | Molecular Devices Corporation, CA, USA | SpectraMax 340 photometer | |
Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | Version 9.0.1 | |
Saline 0.9% NaCl | Fresenius Kabi, Sweden | 883264 | |
Special tail marker block for TVT tail cut | |||
Tail holder | |||
Vacuum liquid suction | Vacusafe comfort, IBS | ||
Waterbath and thermostat | TYP 3/8 Julabo |