Het refined tail vein transection (TVT) bloedingsmodel bij verdoofde muizen is een gevoelige in vivo methode voor de beoordeling van hemofiele bloedingen. Dit geoptimaliseerde TVT-bloedingsmodel gebruikt bloedverlies en bloedingstijd als eindpunten, verfijnt andere modellen en vermijdt de dood als eindpunt.
Staartbloedingsmodellen zijn belangrijke hulpmiddelen in hemofilieonderzoek, met name voor de beoordeling van procoagulante effecten. Het overlevingsmodel voor staartaderdoorsnede (TVT) heeft in veel omgevingen de voorkeur gekregen vanwege de gevoeligheid voor klinisch relevante doses FVIII, terwijl andere gevestigde modellen, zoals het staartclipmodel, hogere niveaus van procoagulante verbindingen vereisen. Om overleving als eindpunt te vermijden, hebben we een TVT-model ontwikkeld dat bloedverlies en bloedingstijd als eindpunten en volledige anesthesie tijdens het hele experiment vaststelt. In het kort worden verdoofde muizen geplaatst met de staart ondergedompeld in een gematigde zoutoplossing (37 °C) en gedoseerd met de teststof in de rechter laterale staartader. Na 5 minuten wordt de linker laterale staartader getransecteerd met behulp van een sjabloongeleider, wordt de staart teruggebracht naar de zoutoplossing en worden alle bloedingsepisoden gedurende 40 minuten gevolgd en geregistreerd tijdens het verzamelen van het bloed. Als er geen bloeding optreedt na 10 minuten, 20 minuten of 30 minuten na het letsel, wordt het stolsel voorzichtig uitgedaagd door de snee twee keer af te vegen met een nat gaasje. Na 40 minuten wordt het bloedverlies gekwantificeerd door de hoeveelheid hemoglobine die in de zoutoplossing bloedt. Deze snelle en relatief eenvoudige procedure resulteert in consistente en reproduceerbare bloedingen. In vergelijking met het TVT-overlevingsmodel gebruikt het een meer humane procedure zonder afbreuk te doen aan de gevoeligheid voor farmacologische interventie. Bovendien is het mogelijk om beide geslachten te gebruiken, waardoor het totale aantal dieren dat moet worden gefokt, wordt verminderd, in overeenstemming met de principes van 3R’s. Een mogelijke beperking in bloedingsmodellen is de stochastische aard van hemostase, die de reproduceerbaarheid van het model kan verminderen. Om dit tegen te gaan, zorgt handmatige stolselverstoring ervoor dat het stolsel tijdens de monitoring wordt uitgedaagd, waardoor primaire (bloedplaatjes) hemostase het bloeden stopt. Deze toevoeging aan de catalogus van bloedingsletselmodellen biedt een optie om procoagulante effecten op een gestandaardiseerde en humane manier te karakteriseren.
Diermodellen zijn essentieel voor het begrijpen van de pathogenese van hemofilie en het ontwikkelen en testen van behandelingsregimes en therapieën. De Factor VIII knock-out muis (F8-KO) is een veelgebruikt model voor de studie van hemofilie A 1,2. Deze muizen recapituleren de belangrijkste kenmerken van de ziekte en zijn op grote schaal gebruikt voor de ontwikkeling van behandelingen, zoals recombinante FVIII-producten 3,4,5 en gentherapiestrategieën 6,7.
Er zijn verschillende bloedingsletselmodellen voor het evalueren van de farmacologische effecten van verschillende hemostatische verbindingen in vivo. Een van deze stollingsmodellen is het overlevingsmodel voor staartadertranssectie bij muizen 8,9,10,11,12,13,14, dat het vermogen van hemofiele muizen meet om exsanguinatie na staarttranssectie te overleven. Deze methode werd meer dan vier decennia geleden15 jaar geleden geïntroduceerd en wordt nog steeds 9,16,17 gebruikt. Het model gebruikt echter overleving als eindpunt en vereist observatie van de dieren gedurende een periode van maximaal 24 uur, waarbij de dieren bij bewustzijn zijn en dus pijn en angst kunnen ervaren.
Bloedingsmodellen van kortere duur en onder volledige anesthesie zijn eerder beschreven, zoals het staartclipmodel (ook bekend als de staartpunt)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Niettemin, voor een volledige normalisatie van bloedverlies na de bloedingsuitdaging, vereisen deze modellen doses procoagulantia (bijv. FVIII) die veel hoger zijn dan die welke klinisch worden toegediend29. Een ander letselmodel onder anesthesie, de vena saphena-bloedingsmethode, is gevoelig voor lagere doses procoagulante verbindingen30, maar vereist een hoog niveau van experimentele interventie omdat de stolsels vaak moeten worden verstoord (in tegenstelling tot 3 keer in het gepresenteerde model).
Standaardisatie naar een gemeenschappelijk protocol voor het testen van nieuwe procoagulante verbindingen zou de gegevensvergelijking tussen laboratoria aanzienlijk vergemakkelijken 31,32,33. In TVT-modellen is er nog geen overeenstemming over bestudeerde eindpunten (bloedverlies 7,26, bloedingstijd 9,34 en overlevingspercentage35,36), en de experimentele lengte varieert tussen studies13.
Ons primaire doel is om een geoptimaliseerd model te beschrijven en te karakteriseren met een hoge reproduceerbaarheid, de mogelijkheid om on-demand te bestuderen, evenals een profylactische behandeling, gevoeligheid voor farmacologische interventie gelijkwaardig aan het overlevingsmodel, maar zonder dood of bijna-dood als eindpunten te gebruiken. Om pijn en angst te verminderen, mogen de dieren niet bij bewustzijn zijn tijdens het bloeden en moet een ethischer eindpunt worden geïmplementeerd37.
Staartclipmodellen worden over het algemeen uitgevoerd in een van de twee varianten, ofwel het amputeren van de punt van de staart, bijvoorbeeld amputatie van 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 of, in een meer ernstige variant, getranseceerd bij een staartdiameter rond 1-3 mm 8,22,25 . Dit veroorzaakt een gecombineerde arterioveneuze bloeding, omdat de laterale en dorsale aderen en ventrale slagader meestal worden doorgesneden, en in het algemeen, hoe groter de amputatie, hoe lager de gevoeligheid voor een procoagulante verbinding. Bovendien, omdat de staartpunt wordt geamputeerd, wordt de arterioveneuze verwonding blootgesteld zonder enig tegengesteld weefsel; dus, althans in theorie, is het anders dan de meest voorkomende hemofiele bloedingen.
Zoals de naam al aangeeft, is alleen de ader gewond in staartadertranssectiemodellen zoals beschreven in dit artikel, wat resulteert in een uitsluitend veneuze bloeding. Omdat het vat niet volledig is afgebroken, zal het letsel naar verwachting kleiner zijn dan in de amputatiemodellen en blijft het weefsel rond de snee, waaraan een stolsel zich kan hechten, behouden. Bovendien is er een lagere bloeddruk in de ader in tegenstelling tot de slagader. Deze factoren dragen bij aan een verhoogde gevoeligheid ten opzichte van amputatiemodellen, zodat normalisatie van bloedingen kan worden bereikt met klinisch relevante doses vervangingstherapie, bijvoorbeeld met rFVIII bij hemofilie A, wat nuttig is voor het evalueren van de omvang en duurzaamheid van effecten van procoagulante behandeling 26,38,39.
Deze geoptimaliseerde methode van staartaderdoorsnede (TVT) heeft verschillende voordelen ten opzichte van de TVT-overlevingsmethode. De dieren worden volledig verdoofd voor de gehele duur van het onderzoek, wat het hanteren van muizen gemakkelijker maakt en het welzijn van de dieren verhoogt. Verder is, in tegenstelling tot het TVT-overlevingsmodel, nachtelijke observatie niet vereist, en dit geoptimaliseerde model biedt de mogelijkheid om bloedverlies te meten en de exacte bloedingstijd gedurende 40 minuten te observer…
The authors have nothing to disclose.
Esther Bloem en Thomas Nygaard worden erkend voor ondersteuning bij metingen van FVIII in plasma. Bo Alsted is erkend voor het tekenen en bewerken van de sjabloon en het snijden van blokken.
#11 Scalpel blade | Swann-Morton | 503 | |
15 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One, Austria | 188271 | |
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing | BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe | 320830 | |
Advate | Takeda, Japan | Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII) | |
Alcohol pads 70% ethanol | Hartmann, Soft-Zellin | 999 979 | |
Centrifuge | Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech | ||
Cutting template (Stainless steel) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm | |
Erythrocytes (RBC) lysing solution | Lysebio, ABX Diagnostics | 906012 | |
Gauze | |||
Haematological analyser | Sysmex | CT-2000iv | |
Heating lamp on stand | Phillips | IR250 | |
Heating pad with thermostat | CMA | model 150 | |
Hemoglobin standards and controls – 8.81 mmol / l batch dependent | HemoCue, Denmark | HemoCue calibrator, 707037 | Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH). |
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box | Sigma Delta Dameca | ||
Isoflurane | Baxter | 26675-46-7 | |
Magnifier with lights | Eschenbach | ||
Measuring template (Aluminum) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm | |
Micropipettes + tips | Finnpipette | ||
Photometer | Molecular Devices Corporation, CA, USA | SpectraMax 340 photometer | |
Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | Version 9.0.1 | |
Saline 0.9% NaCl | Fresenius Kabi, Sweden | 883264 | |
Special tail marker block for TVT tail cut | |||
Tail holder | |||
Vacuum liquid suction | Vacusafe comfort, IBS | ||
Waterbath and thermostat | TYP 3/8 Julabo |