Il modello di sanguinamento della transezione della vena della coda raffinata (TVT) nei topi anestetizzati è un metodo sensibile in vivo per la valutazione del sanguinamento emofilico. Questo modello di sanguinamento TVT ottimizzato utilizza la perdita di sangue e il tempo di sanguinamento come endpoint, perfezionando altri modelli ed evitando la morte come endpoint.
I modelli di sanguinamento della coda sono strumenti importanti nella ricerca sull’emofilia, in particolare per la valutazione degli effetti procoagulanti. Il modello di sopravvivenza alla transezione della vena caudale (TVT) è stato preferito in molti contesti a causa della sensibilità a dosi clinicamente rilevanti di FVIII, mentre altri modelli consolidati, come il modello di clip di coda, richiedono livelli più elevati di composti procoagulanti. Per evitare di utilizzare la sopravvivenza come endpoint, abbiamo sviluppato un modello TVT che stabilisce la perdita di sangue e il tempo di sanguinamento come endpoint e l’anestesia completa durante l’intero esperimento. In breve, i topi anestetizzati vengono posizionati con la coda immersa in soluzione salina temperata (37 ° C) e dosati con il composto di prova nella vena laterale destra della coda. Dopo 5 minuti, la vena laterale sinistra della coda viene trasettata utilizzando una guida modello, la coda viene restituita alla soluzione salina e tutti gli episodi emorragici vengono monitorati e registrati per 40 minuti durante la raccolta del sangue. Se non si verifica alcun sanguinamento a 10 minuti, 20 minuti o 30 minuti dopo l’infortunio, il coagulo viene sfidato delicatamente pulendo il taglio due volte con un tampone di garza bagnato. Dopo 40 minuti, la perdita di sangue è quantificata dalla quantità di emoglobina sanguinata nella soluzione salina. Questa procedura veloce e relativamente semplice si traduce in sanguinamenti coerenti e riproducibili. Rispetto al modello di sopravvivenza TVT, utilizza una procedura più umana senza compromettere la sensibilità all’intervento farmacologico. Inoltre, è possibile utilizzare entrambi i sessi, riducendo il numero totale di animali che devono essere allevati, nel rispetto dei principi delle 3R. Una potenziale limitazione nei modelli di sanguinamento è la natura stocastica dell’emostasi, che può ridurre la riproducibilità del modello. Per contrastare questo, l’interruzione manuale del coagulo assicura che il coagulo venga sfidato durante il monitoraggio, impedendo all’emostasi primaria (piastrinica) di fermare il sanguinamento. Questa aggiunta al catalogo di modelli di lesioni emorragiche offre un’opzione per caratterizzare gli effetti procoagulanti in modo standardizzato e umano.
I modelli animali sono essenziali per comprendere la patogenesi dell’emofilia e sviluppare e testare regimi di trattamento e terapie. Il topo knock-out fattore VIII (F8-KO) è un modello ampiamente utilizzato per lo studio dell’emofilia A 1,2. Questi topi ricapitolano le caratteristiche chiave della malattia e sono stati ampiamente utilizzati per lo sviluppo di trattamenti, come i prodotti FVIII ricombinanti 3,4,5 e le strategie di terapia genica 6,7.
Esistono vari modelli di lesioni emorragiche per valutare gli effetti farmacologici di diversi composti emostatici in vivo. Uno di questi modelli di coagulazione è il modello di sopravvivenza alla traslazione della vena della coda nei topi 8,9,10,11,12,13,14, che misura la capacità dei topi emofili di sopravvivere al dissanguamento dopo la traslazione della coda. Questo metodo è stato introdotto più di quattro decenni fa15 ed è ancora utilizzato 9,16,17. Tuttavia, il modello utilizza la sopravvivenza come endpoint e richiede l’osservazione degli animali per un periodo fino a 24 ore, durante il quale gli animali sono coscienti e quindi possono provare dolore e angoscia.
Modelli sanguinanti di durata più breve e in anestesia completa sono stati descritti in precedenza, come il modello di clip di coda (noto anche come punta della coda)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Tuttavia, per una completa normalizzazione della perdita di sangue dopo la sfida emorragica, questi modelli richiedono dosi di composti procoagulanti (ad esempio, FVIII) molto più elevate di quelle somministrate clinicamente29. Un diverso modello di lesione in anestesia, il metodo di sanguinamento della vena saphena, è sensibile a dosi più basse di composti procoagulanti30, ma richiede un alto livello di intervento dello sperimentatore poiché i coaguli devono essere interrotti frequentemente (al contrario di 3 volte nel modello presentato).
La standardizzazione verso un protocollo comune per testare nuovi composti procoagulanti faciliterebbe notevolmente il confronto dei dati tra i laboratori 31,32,33. Nei modelli TVT, non esiste ancora un accordo comune sugli endpoint studiati (perdita di sangue 7,26, tempo di sanguinamento 9,34 e tasso di sopravvivenza 35,36) e la lunghezza sperimentale varia tra gli studi13.
Il nostro obiettivo primario è quello di descrivere e caratterizzare un modello ottimizzato con elevata riproducibilità, la possibilità di studiare on-demand e un trattamento profilattico, la sensibilità all’intervento farmacologico equivalente al modello di sopravvivenza, ma non utilizzando la morte o la pre-morte come endpoint. Al fine di ridurre il dolore e l’angoscia, gli animali non dovrebbero essere coscienti durante il sanguinamento e un endpoint più etico deve essere implementato37.
I modelli di clip di coda sono generalmente condotti in una delle due varianti, amputando la punta della coda, ad esempio amputazione di 1-5 mm 18,19,20,21,23,24 o, in una variante più grave, transettata ad un diametro di coda di circa 1-3 mm 8,22,25 . Ciò provoca un sanguinamento artero-venoso combinato, poiché le vene laterali e dorsali e l’arteria ventrale sono solitamente recise e, in generale, maggiore è l’amputazione, minore è la sensibilità a un composto procoagulante. Inoltre, poiché la punta della coda viene amputata, la lesione artero-venosa viene esposta senza alcun tessuto opposto; quindi, almeno in teoria, è dissimile dai più comuni sanguinamenti emofilici.
Come suggerisce il nome, solo la vena è ferita nei modelli di trasezione della vena della coda come descritto in questo articolo, causando così un sanguinamento esclusivamente venoso. Poiché il vaso non è completamente reciso, la lesione dovrebbe essere più piccola rispetto ai modelli di amputazione e il tessuto intorno al taglio, a cui un coagulo può aderire, viene trattenuto. Inoltre, c’è una pressione sanguigna più bassa nella vena rispetto all’arteria. Questi fattori contribuiscono ad una maggiore sensibilità rispetto ai modelli di amputazione, in modo tale che la normalizzazione del sanguinamento può essere raggiunta con dosi clinicamente rilevanti di terapia sostitutiva, ad esempio con rFVIII nell’emofilia A, che è utile per valutare l’entità e la durata degli effetti del trattamento procoagulante 26,38,39.
Questo metodo ottimizzato di transezione della vena della coda (TVT) presenta diversi vantaggi rispetto al metodo di sopravvivenza TVT. Gli animali sono completamente anestetizzati per l’intera durata dello studio, il che rende più facile la manipolazione del topo e aumenta il benessere degli animali. Inoltre, a differenza del modello di sopravvivenza TVT, non è richiesta l’osservazione notturna e questo modello ottimizzato offre la possibilità di misurare la perdita di sangue e osservare il tempo esatto di sanguiname…
The authors have nothing to disclose.
Esther Bloem e Thomas Nygaard sono riconosciuti per il supporto con le misurazioni di FVIII nel plasma. Bo Alsted è riconosciuta per aver disegnato e lavorato la sagoma e i blocchi di taglio.
#11 Scalpel blade | Swann-Morton | 503 | |
15 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One, Austria | 188271 | |
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing | BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe | 320830 | |
Advate | Takeda, Japan | Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII) | |
Alcohol pads 70% ethanol | Hartmann, Soft-Zellin | 999 979 | |
Centrifuge | Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech | ||
Cutting template (Stainless steel) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm | |
Erythrocytes (RBC) lysing solution | Lysebio, ABX Diagnostics | 906012 | |
Gauze | |||
Haematological analyser | Sysmex | CT-2000iv | |
Heating lamp on stand | Phillips | IR250 | |
Heating pad with thermostat | CMA | model 150 | |
Hemoglobin standards and controls – 8.81 mmol / l batch dependent | HemoCue, Denmark | HemoCue calibrator, 707037 | Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH). |
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box | Sigma Delta Dameca | ||
Isoflurane | Baxter | 26675-46-7 | |
Magnifier with lights | Eschenbach | ||
Measuring template (Aluminum) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm | |
Micropipettes + tips | Finnpipette | ||
Photometer | Molecular Devices Corporation, CA, USA | SpectraMax 340 photometer | |
Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | Version 9.0.1 | |
Saline 0.9% NaCl | Fresenius Kabi, Sweden | 883264 | |
Special tail marker block for TVT tail cut | |||
Tail holder | |||
Vacuum liquid suction | Vacusafe comfort, IBS | ||
Waterbath and thermostat | TYP 3/8 Julabo |