हम आधुनिक फ्लोरेसेंस लेबलिंग तकनीकों का उपयोग करके लाइव कोशिकाओं में झिल्ली रिसेप्टर गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए ओपन सेल ड्यूल-कलर फ्लोरेसेंस क्रॉस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीसीएस) का प्रदर्शन करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और डेटा विश्लेषण कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं।
हम आधुनिक फ्लोरेसेंस लेबलिंग तकनीकों का उपयोग करके लाइव कोशिकाओं में झिल्ली रिसेप्टर गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए फ्लोरेस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरटी) के साथ संयुक्त लाइव सेल ड्यूल-कलर फ्लोरेसेंस क्रॉस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीसीएस) का प्रदर्शन करने के लिए एक प्रोटोकॉल और कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं। दोहरे रंग के एफसीसीएस में, जहां फ्लोरेसेंस तीव्रता में उतार-चढ़ाव संबंधित फ्लोरोसेंट बायोमॉलिक्यूल के गतिशील “फिंगरप्रिंट” का प्रतिनिधित्व करते हैं, हम रिसेप्टर्स के सह-प्रसार या बाध्यकारी की जांच कर सकते हैं। FRET, आणविक दूरी के लिए अपनी उच्च संवेदनशीलता के साथ, इंट्रामोलिकुलर परिवर्तनों की निगरानी के लिए एक प्रसिद्ध “नैनोरूलर” के रूप में कार्य करता है । एक साथ लिया गया, अनुरूप परिवर्तन और स्थानीय रिसेप्टर सांद्रता और गतिशीलता स्थिरांक जैसे प्रमुख पैरामीटर सेलुलर सेटिंग्स में सुलभ हो जाते हैं।
मात्रात्मक फ्लोरेसेंस दृष्टिकोण उच्च शोर के स्तर और नमूने की संवेदनशीलता के कारण कोशिकाओं में चुनौतीपूर्ण हैं। यहां हम दिखाते हैं कि इस प्रयोग को कैसे किया जाए, जिसमें 2-एड्रेनेरिक रिसेप्टर (β2एआर) β लेबल वाले दोहरे रंग वाले लेबल का उपयोग करके अंशांकन चरण शामिल हैं, जो eGFP और स्नैप-टैग-TAMRA के साथ लेबल किया गया है। ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर और टेम्पलेट्स का उपयोग करके एक कदम-दर-चरण डेटा विश्लेषण प्रक्रिया प्रदान की जाती है जो अनुकूलित करना आसान है।
हमारा दिशानिर्देश शोधकर्ताओं को लाइव सेल प्रयोगों में सीमित सिग्नल-टू-शोर स्तर के बावजूद उच्च विश्वसनीयता के साथ सीटू में लाइव कोशिकाओं में जैव अणुओं के आणविक बातचीत को जानने में सक्षम बनाता है। कम सांद्रता पर FRET और विशेष रूप से एफसीसीएस की परिचालन खिड़की लगभग शारीरिक स्थितियों पर मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देती है।
फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी एक सेलुलर संदर्भ में न्यूनतम क्षोभ के साथ प्रोटीन गतिशीलता और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की मात्रा निर्धारित करने के लिए मुख्य तरीकों में से एक है। कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) आणविक गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए शक्तिशाली तरीकों में से एक है क्योंकि यह एकल अणु संवेदनशील, अत्यधिक चयनात्मक और लाइव-सेल संगत1है। अन्य गतिशीलता उन्मुख दृष्टिकोणों की तुलना में, एफसीएस में ~ एनएस से ~ एस तक फैले एक व्यापक औसत दर्जे की समय सीमा है, जो सबसे महत्वपूर्ण रूप से तेजी से समय तराजू को कवर करता है जो अक्सर इमेजिंग-आधारित तरीकों से दुर्गम होते हैं। इसके अलावा, यह स्थानिक चयनशीलता भी प्रदान करता है ताकि झिल्ली, साइटोप्लाज्मिक और नाभिक आणविक गतिशीलता को आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सके 2। इस प्रकार, आणविक निमिष, औसत स्थानीय एकाग्रता, और प्रसार गुणांक एफसीएस के साथ मात्रात्मक रूप से विश्लेषण किया जा सकता है। एक दोहरे रंग के दृष्टिकोण में फ्लोरेसेंस क्रॉस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीसीएस) विश्लेषण3,4,5 में दो आणविक प्रजातियों के सह-प्रसार की जांच करते समय बाध्यकारी जैसी इंटरमॉलिकुलर गतिशीलता आसानी से सुलभ हो जाती है।
सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी में मुख्य अंतर्निहित सिद्धांत फ्लोरोसेंट रूप से लेबल किए गए बायोमॉलिक्यूल्स द्वारा उत्सर्जित तीव्रता के उतार-चढ़ाव का सांख्यिकीय विश्लेषण है और लेजर फोकस(चित्रा 1 ए)में और बाहर फैलाना है। परिणामस्वरूप ऑटो-या क्रॉस-सहसंबंध कार्यों को अंततः ब्याज की दर स्थिरांक प्राप्त करने के लिए वक्र फिटिंग द्वारा आगे विश्लेषण किया जा सकता है। दूसरे शब्दों में, सांख्यिकीय तरीकों FCS और FCCS एकल कण ट्रैकिंग में की तरह एक अणु निशान प्रदान नहीं करते हैं, लेकिन एक गतिशील पैटर्न या उच्च लौकिक संकल्प के साथ एक जांच नमूना के “फिंगरप्रिंट” । जब फॉस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरटी) के साथ संयुक्त किया जाता है, तो एक सामान्य कॉन्फोकल सेटअप5, 6में एक ही समय में इंट्रामोलिकुलर गतिशीलता जैसे अनुरूपपरिवर्तनोंकी निगरानी की जा सकती है। FRET दो फ्लोरोफोरस की दूरी की जांच करता है और अक्सर एक आणविक “नैनोरूलर” के रूप में जाना जाता है। ऊर्जा हस्तांतरण तभी होता है जब अणु निकट क्षेत्र (10 एनएम <) में होते हैं, दाता का उत्सर्जन स्पेक्ट्रम स्वीकारकर्ता अणु के अवशोषण स्पेक्ट्रम के साथ काफी ओवरलैप होता है, और दाता और स्वीकारकर्ता का डाइपोल अभिविन्यास (पर्याप्त रूप से) समानांतर होता है। इस प्रकार, FRET और एफसीसीएस का संयोजन बहुत उच्च स्थानिक-लौकिक संकल्प के साथ एक तकनीक प्रदान करता है। जब स्थानिक चयनशीलता, संवेदनशीलता के साथ-साथ लाइव-सेल अनुकूलता की आवश्यकता होती है, तो यूआरटी-एफसीसीएस में प्रोटीन गतिशीलता और बातचीत को मापने के लिए अन्य तरीकों जैसे आइसोथेमल टिटरेशन कैलोरिमेट्री (आईटीसी)7,सरफेस प्लाजन अनुनाद (एसपीआर)8,या परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर)9,10 पर स्पष्ट लाभप्रद है।
दोहरी रंग फ्लोरेसेंस क्रॉस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (डीसी-एफसीसीएस) की क्षमताओं और वादे के बावजूद, लाइव कोशिकाओं में डीसी-एफसीसीएस का प्रदर्शन चैनलों3,4केबीच स्पेक्ट्रल ब्लीड-थ्रू या क्रॉसटॉक के कारण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, स्पेक्ट्रली अलग लेजर लाइनों3,4,11,पृष्ठभूमि संकेत, पृष्ठभूमि के कारण कॉन्फोकल वॉल्यूम में अंतर और शोर या नमूनों की सीमित फोटोस्थेपन12, 13,14,15. पल्स इंटरलीव्ड एक्सिटेशन (पाई) का एफसीसीएस में परिचय चैनलों के बीच स्पेक्ट्रल क्रॉसटॉक को कम करने केलिए विभिन्न लेजर उत्तेजन को अस्थायी रूप से अलग करने के लिए एक महत्वपूर्ण ट्विक था। स्पेक्ट्रल ब्लीड-थ्ंड17 , 18,19 और पृष्ठभूमि सुधार का मुकाबला करने के अन्य सुधार तरीकों को भी17,18, 19के माध्यम से अच्छीतरहसे स्वीकार किया गया है। एफसीएस, पाई या एफईटी पर विवरण और मूल बातों के लिए पाठक को निम्नलिखित संदर्भों 2,4, 6,16,20,21,22,23,24केसंदर्भोंमें संदर्भित कियाजाताहै।
यहां, सभी आवश्यक अंशांकन प्रयोगों और विश्लेषण के साथ एक प्रोटोटाइप जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर के प्रयोगात्मक परिणामों के साथ, β 2-adrenergic रिसेप्टर (β2एआर), तीन अलग परिदृश्यों के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं: (1) एकल लेबल अणुओं या तो एक “ग्रीन” (eGFP) या एक “लाल” (स्नैप टैग आधारित लेबल)25 फ्लोरो (2) एक डबल लेबल निर्माण, जो एक एन टर्मिनल स्नैप टैग और इंट्रासेल्युलर eGFP (एनटी-स्नैप) किया जाता है [इस मामले में, दोनों लेबल एक ही प्रोटीन पर हैं । इस प्रकार 100% सह-प्रसार की उम्मीद है]; और (3) एक डबल लेबल नमूना है, जहां दोनों फ्लोरोफोरस कोशिका झिल्ली (सीटी-स्नैप) के एक ही पक्ष पर हैं । इसमें सी-टर्मिनल स्नैप-टैग और इंट्रासेल्युलर ईजीएफपी दिया गया है । यहां, फिर से दोनों लेबल फिर से १००% सह प्रसार की उम्मीद के साथ एक ही प्रोटीन पर हैं । चूंकि दोनों लेबल एक दूसरे के बहुत करीब हैं, सेल झिल्ली के एक ही तरफ, यह FRET और विरोधी व्यवहार का निरीक्षण करने की क्षमता दिखाता है। सभी निर्माण चीनी हम्सटर अंडाशय (चो) कोशिकाओं में संक्रमित थे और बाद में एक लाल फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट के साथ लेबल किए गए थे जो एनटी-स्नैप निर्माण और सीटी-स्नैप निर्माण के लिए झिल्ली-पारगम्य के लिए झिल्ली-अभेद्य है। अंत में, नकली डेटा FRET-प्रेरित एंटीकोरिएलेशन पर प्रयोगात्मक मापदंडों के प्रभाव और सह-प्रसार आयाम पर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के प्रभाव का उदाहरण देता है।
इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल तकनीकी/भौतिक कलाकृतियों, चुनौतियों और संभावित समाधानों के बारे में जागरूक करते हुए प्रोटीन गतिशीलता और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को समझने के लिए जीवित कोशिकाओं में संयुक्त FRET-एफसीसीओं का प्रदर्शन करने के लिए एक पूर्ण गाइड प्रदान करता है ।
जीपीसीआर में एफसीएस तकनीक जीवित कोशिकाओं के अंदर रिसेप्टर्स की गतिशीलता और बातचीत को41का आकलन करने की अनुमति देती है । FRET-FCS तकनीक का लाभ यह है कि, गतिशीलता के साथ, जीपीसीआर की संरचना गतिशीलता की जांच की जा सकती है। हालांकि, लाइव कोशिकाओं में FRET-FCS प्रदर्शन चुनौतीपूर्ण है और कोशिकाओं जो कम (या अधिकतम मध्यम) ब्याज की फ्लोरोसेंटली लेबल प्रोटीन, एक अच्छी तरह से अंशांकित सेटअप और डेटा का विश्लेषण करने के लिए एक अच्छी पाइपलाइन की अभिव्यक्ति दिखाने की आवश्यकता है । यहां, पहले नमूना तैयारी और प्रयोगात्मक प्रक्रिया में महत्वपूर्ण बिंदुओं पर जैविक, स्पेक्ट्रोस्कोपिक और तकनीकी दृष्टिकोण के विषय में चर्चा की जाती है।
महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक चरणों में पृष्ठभूमि और ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करना (बड़े पैमाने पर साफ किए गए कवरस्लिप और फिनोल-रेड फ्री मीडिया का उपयोग करके), ट्रांसफैक्शन स्थितियों का अनुकूलन (उदाहरण के लिए, प्लाज्मिड डीएनए की मात्रा और ट्रांसफैक्शन के बाद का समय) कम अभिव्यक्ति के स्तर और कुशल लेबलिंग को प्राप्त करने के लिए शामिल है। बेशक, यह सुनिश्चित करना भी महत्वपूर्ण है कि लेबल प्रोटीन का कार्य बाधित न हो। इस प्रकार, लाइव-सेल प्रयोगों में, लेबलिंग रणनीति और लेबल स्थिति के लिए निर्णय अक्सर फ्लोरोसेंट प्रोटीन या स्नैप/क्लिप टैग के पक्ष में किया जाता है जो लचीले एन-या सी-टर्मिनस४२,४३से जुड़ा होता है । ऑर्गेनिक फ्लोरोफोर के साथ लेबलिंग के लिए एक प्रतिक्रियाशील साइड चेन के साथ अप्राकृतिक अमीनो एसिड डालने जैसी वैकल्पिक लेबलिंग रणनीतियां पिछलेवर्षोंमें उभर रही हैं ।
दोहरे रंग पाई-एफसीएस के लिए, जहां केवल ब्याज के दो अणुओं की बातचीत की जांच की जानी है, फ्लोरोफोरेस को स्थापित फ्लोरोसेंट प्रोटीन या स्नैप/क्लिप सब्सट्रेट्स की एक बड़ी विविधता से चुना जा सकता है । यहां, स्पेक्ट्रोस्कोपी-वार लक्ष्य एक जोड़ी का चयन करना होना चाहिए जैसे कि थोड़ा क्रॉसटॉक या प्रत्यक्ष स्वीकार्य उत्तेजन हो। इसके अतिरिक्त, चयनित फ्लोरोफोरेस फोटोस्टेबल होना चाहिए और चुने हुए प्रयोगात्मक परिस्थितियों में कम या कोई ब्लीचिंग नहीं दिखाना चाहिए। लाल स्पेक्ट्रल रेंज में फ्लोरोफोरस का चयन करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि (1) कोशिका से ऑटोफ्लोरेसेंस पृष्ठभूमि कम हो जाती है और (2) उत्तेजन प्रकाश लंबी तरंगदैर्ध्य का होता है, इस प्रकार कम फोटोटॉक्सिक14। फोटोब्लेचिंग को पहले तथाकथित “पावर सीरीज” आयोजित करके कम किया जा सकता है, जिसमें लेजर शक्ति को स्टेपवाइज बढ़ाया जाता है, और आणविक चमक देखी जाती है। इष्टतम उत्तेजन तीव्रता सीमा परिणामों की रैखिक सीमा45में निहित है।
यदि दो लेबल FRET के माध्यम से प्रोटीन अनुरूप गतिशीलता पर भी रिपोर्ट करने के लिए माना जाता है तो उपलब्ध फ्लोरोफोरेस की पसंद अधिक प्रतिबंधित है । यहां, दो फ्लोरोफोरस के बीच संभावित न्यूनतम/अधिकतम दूरी का अनुमान पहले से ही लगाया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, उपलब्ध संरचनाओं या आणविक आकार के आधार पर, और एक फ्लोरोफोर जोड़ी जिसे उचित फॉस्टर त्रिज्या आर0 के साथ चुना गया है, जैसे कि FRET वास्तव में20हो सकता है।
यहां, eGFP और एक स्नैप टैग लेबलिंग के लिए चुना गया था, और स्नैप टैग या तो एक इंट्रासेल्युलर या एक झिल्ली अभेद्य सतह सब्सट्रेट के साथ लेबल किया गया था । स्पेक्ट्रा चित्रा 2C-Dमें दिखाए गए लोगोंकेसमान हैं । फ्लोरोफोरस का यह संयोजन रेड डिटेक्शन चैनलों में ईजीएफपी के उच्च क्रॉसटॉक और त्वरित समय खिड़की में हरे रंग की उत्तेजन द्वारा स्नैप सब्सट्रेट के प्रत्यक्ष स्वीकार्यता को दर्शाता है और परिणामस्वरूप त्वरित समय खिड़की में लाल चैनलों में एक महत्वपूर्ण “झूठी” संकेत होता है। आदर्श रूप से, दोनों मूल्य, क्रॉस टॉक और प्रत्यक्ष स्वीकार्यता, 5% 5,6,38से अधिक नहीं होना चाहिए। हालांकि, 57 Å के एक Förster त्रिज्या के साथ, यह आदर्शβ 2AR-IL3-eGFP-सीटी-स्नैप निर्माण में लेबल के बीच की दूरी की जांच करने के लिए अनुकूल है के रूप में quenched eGFP आजीवन (अनुपूरक नोट 5) से मूल्यांकन किया जा सकता है ।
तकनीकी रूप से, किसी भी फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोग के लिए, डिवाइस को अच्छी तरह से गठबंधन किया जाना चाहिए और इसमें उपयुक्त उत्तेजन स्रोत, उत्सर्जन फ़िल्टर और संवेदनशील डिटेक्टर होने चाहिए। μs टाइमस्केल पर डिटेक्टर afterpulsing से कलाकृतियों से बचने के लिए, प्रत्येक रंग के कम से कम दो डिटेक्टरों मौजूद होना चाहिए, जो पार सहसंबद्ध किया जा सकता है। आधुनिक समय सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती इलेक्ट्रॉनिक्स में, एनएस समय सीमा में पता लगाने वाले कार्ड का मृत समय स्वतंत्र रूटिंग चैनलों के कारण शायद ही कोई भूमिका निभाता है, हालांकि, इसे मुलर एट अल 16 द्वारा प्रस्तावित के रूप में जांचा जा सकता है ब्याज की समय सीमा उप-μs/ns समय सीमा में निहित है । इसके अतिरिक्त, पीएस रेंज में भी अधिक समय के संकल्पों के लिए, प्रत्येक डिटेक्शन चैनल को दोगुना किया जाना चाहिए, यानी, प्रति रंग चार डिटेक्टरों का उपयोग किया जाना चाहिए, ताकि डिटेक्टरडेड टाइम्स2, 15,29,46को भी बाईपास किया जा सके। जबकि औसत फ्लोरेसेंस जीवनकाल का अनुमान गैर-ध्रुवीकृत फ्लोरेसेंस डिटेक्शन का उपयोग करके लगाया जा सकता है, फ्लोरोफोरस के बीच दूरी (~ वितरण) के विश्लेषण के लिए उत्सर्जन को ध्रुवीकरण-निर्भर एकत्र किया जाना चाहिए। यह इस तथ्य के कारण है कि FRET में ऊर्जा हस्तांतरण की दक्षता दो फ्लोरोफोरस के अभिविन्यास पर निर्भर करती है। अधिक विस्तृत जानकारी यहां20,28,47प्राप्त की जा सकती है . अंत में, पाई प्रयोगों में, त्वरित और देरी नाड़ी के बीच की दूरी महत्वपूर्ण है और इसे इस तरह चुना जाना चाहिए कि फ्लोरोफोरस की फ्लोरोसेंस तीव्रता काफी हद तक क्षय हो गई है(चित्रा 1 बी)। एक आम नियम यह है कि दो दालों को फ्लोरेसेंस लाइफटाइम के अलावा रखा जाए, यानी 2.5 एनएस के फ्लोरेसेंस लाइफटाइम के साथ ईजीएफपी के लिए दूरी न्यूनतम 22 पर12.5 एनएसहोनी चाहिए।
प्रायोगिक प्रक्रिया के लिए सभी विचारों को विस्तृत करने के बाद, डेटा और उसके विश्लेषण पर अधिक विस्तार से चर्चा की जाती है । जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लेख किया गया है, सेटअप के संरेखण की दैनिक जांच की जानी चाहिए, जिसमें अंशांकन मापों का विश्लेषण शामिल है। चित्रा 2A-C में दिखाया गया डेटा, उदाहरण के लिए, 8-40 माइक्रोन रेंज में एक अतिरिक्त छूट घटक दिखाता है। हरे अंशांकन फ्लोरोफोर की विशिष्ट ट्रिपल पलक 2-10 माइक्रोस रेंज13 , 15,48में होने के लिए जानाजाताहै। डीएनए नमूने(चित्रा 3C)के सभी घटता में आवश्यक धीमी गति से छूट घटक, वास्तविक ट्रिपल निमिष के लिए बहुत धीमा, फ्लोरोफोरेस39के साथ डीएनए की बातचीत से स्टेम हो सकता है। हालांकि, सीसीएफपाईमें इस घटक की उम्मीद नहीं की जाएगी, और सबसे अधिक संभावना अवशिष्ट क्रॉसटॉक से उपजी है। इस प्रकार, दिन के संरेखण की गुणवत्ता का न्याय करने के लिए सेल प्रयोगों पर आगे बढ़ने से पहले सीधे अंशांकन नमूनों का विश्लेषण करना अत्यधिक उचित है।
कॉन्फोकल ओवरलैप वॉल्यूम के उचित अंशांकन के लिए हरे और लाल लेबल के 100% सह-प्रसार के साथ एक नमूना की आवश्यकता होती है। यहां फ्लोरोसेंटी लेबल डबल फंसे डीएनए का इस्तेमाल किया जाता है । दोनों डीएनए किस्में एक दूसरे से आवश्यक दूरी पर वांछित फ्लोरोफोरस के अनुरूप किया जा सकता है । डिजाइन की गई किस्में उच्च उपज के साथ एनील्ड की जा सकती हैं। हालांकि, अच्छी प्रयोगशाला अभ्यास एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा डीएनए किस्में की अखंडता और लेबलिंग डिग्री की जांच करने और अवशोषण स्पेक्ट्रम को मापने की सलाह देता है। इसके अलावा, डबल-फंसे असेंबली की उपज की जांच की जानी चाहिए क्योंकि यह अंशांकन माप गंभीर रूप से इस धारणा पर निर्भर करता है कि लाल लेबल के साथ हरे रंग का 100% सह-प्रसार है। यदि धारणा मान्य नहीं है, तो सुधार कारकों को16,22लागू करना पड़ सकता है। चित्रा 2 और चित्रा 3में दिखाए गए अंशांकन मापों में, हरे और लाल चैनल में क्रमशः 1.4 एमएल और 1.9 एमएल की पहचान की मात्रा प्राप्त की गई थी। यह आकार अंतर लगभग विवर्तन-सीमित एक्सिटेशन वॉल्यूम(अनुपूरक नोट 2)के साथ एक सेटअप के लिए अपेक्षित है। इस शर्त के तहत, उत्तेजन तरंगदैर्ध्य के साथ उत्तेजन मात्रा तराजू का आकार। इसके बदले में चित्र 3बीमें देखे गए विभिन्न सहसंबंध आयामों के बारे में बताया गया है । व्युत्पन्न सुधार कारक आरजीआर = 0.56 और आर आरआरजी = 0.72 सही इस आकार विसंगति और संभावित गैर सही दो उत्तेजन मात्रा3,4के ओवरलैप के लिए सही है।
चित्रा 4, चित्रा 5, चित्रा 6,और चित्रा 7 एक पाई-एफ (सी) सीएस आधारित अध्ययन के कार्यप्रवाह का प्रदर्शन अनुरूप प्रोटीन गतिशीलता को समझने की दिशा में उद्देश्य । सबसे पहले, दो एकल लेबल निर्माण β2एआर-IL3-eGFP और एनटी-स्नैप-β2एआर संबंधित अन्य फ्लोरोफोर(चित्रा 4)की अनुपस्थिति में कोशिकाओं में फ्लोरोफोर गुणों की विशेषता के लिए नियंत्रण के रूप में काम करते हैं। इसके बाद, डबल-लेबल निर्माण एनटी-स्नैप-β2एआर-आईएल3-ईजीएफपी एक स्नैप-टैग को ले जा रहा है जो सेल बाहरी और साइटोप्लाज्मिक पक्ष पर एक eGFP का सामना कर रहा है जो “100% सह-प्रसार” नियंत्रण(चित्रा 5)के रूप में कार्य करता है। पिछले निर्माण,β 2एआर-IL3-eGFP-सीटी-स्नैप, साइटोप्लाज्मिक पक्ष पर दोनों फ्लोरोफोरस किया जाता है और काफी करीब एक साथ FRET से गुजरना । यहां, फिर से एक 100% सह-प्रसार की उम्मीद की जाएगी, जो त्वरित समय खिड़की में हरे और लाल चैनलों के संकेत में विरोधी सह-सहसंबद्ध तीव्रता के उतार-चढ़ाव के साथ मिलकर, यानी दाता उत्तेजना के बाद, FRET दक्षता31,32, 33को प्रभावित करने वाली प्रोटीन गतिशीलता के कारण। यह गतिशीलता सीसीएफएफईआरटी (चित्रा 6-7)में विरोधी सहसंबंध के रूप में दिखाई दे सकती है।
सभी जीपीसीआर β2एआर स्ट्रक्स्ट्रेशन सेल झिल्ली(चित्रा 4A)पर बिमोडल प्रसार दिखाते हैं। जबकि β2एआर-IL3-eGFP केवल अपेक्षित ट्रिपल निमिष(चित्रा 5B)13,15,एनटी-स्नैप-β2एआर एक अतिरिक्त धीमी छूट समय(चित्रा 5C-D)दिखाता है । यह संभावना है कि टीR2 अनबाउंड स्नैप सब्सट्रेट से स्टेम हो सकता है । यह आगे के प्रयोगों द्वारा स्पष्ट किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, एक जलीय समाधान में उपयोग किए गए स्नैप सब्सट्रेट के प्रसार और फोटोफिजिकल गुणों को भी मापकर। ध्यान दें, प्रसार और विश्राम के समय के बीच अंतर करने के लिए एक सीधा प्रयोग कॉन्फोकल सेटअप के पिनहोल को बदलना है, यानी, प्रभावी मात्रा में वृद्धि: जबकि प्रसार के समय में प्रभावी मात्रा में वृद्धि होती है, विश्राम की शर्तें अनछुए13हैं। फिट परिणामों के आधार पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) की एकाग्रता का निर्धारण करते समय, ध्यान रखें कि सामान्य रूप से एफपीएस एक परिपक्वता प्रक्रिया से गुजरता है, जिसमें अंत में क्रोमोफोर12का गठन होता है। यह परिपक्वता का समय एफपी से एफपी तक हो सकता है और इसके अलावा फोटोफिजिक्स भी हो सकते हैं जो स्थानीय रासायनिक वातावरण पर निर्भर करता है13,15. इस प्रकार, एफसीएस द्वारा सूचित नमूने में मौजूद वास्तविक प्रोटीन एकाग्रता को आमतौर पर कम करके आंका जाता है, जिसे सही किया जा सकता है यदि प्रयोग में गैर-फ्लोरोसेंट एफपीएस का अंश निर्धारित किया जा सकता है। अंत में, यदि आवश्यक हो तो α और δ के लिए मूल्यों को सही करने के लिए जीवित कोशिकाओं में फ्लोरोफोर स्पेक्ट्रा की जांच करने की सलाह दी जाती है, क्योंकि अधिकांश फ्लोरोफोरस अपने पर्यावरण13,15,48के प्रति संवेदनशील प्रतिक्रिया करते हैं। घटाना करने के लिए पृष्ठभूमि गैर संक्रमित कोशिकाओं में एकत्र संकेत द्वारा निर्धारित किया जाता है। इसके अतिरिक्त, संबंधित अन्य रंग चैनल और सीसीएफपाई के ऑटोकोरिएलेशन की जांच की जानी चाहिए ताकि झूठे संकेतों(अनुपूरक नोट 4 – चित्रा 30)की पहचान कर सके।
एनटी-स्नैप-β2एआर-आईएल3-ईजीएफपी(चित्रा 5डी)से दो माप, जहां फ्लोरोफोरस झिल्ली के विभिन्न किनारों पर स्थित हैं, विभिन्न दिनों पर अधिग्रहीत किए गए थे और समय-हल एकल अणु फ्लोरेसेंस में आंकड़ों के महत्व को दर्शाते हैं । यहां, विभिन्न परिणाम लेबलिंग की विभिन्न डिग्री के कारण हो सकते हैं: एक सेल में लेबलिंग की उच्च डिग्री और माप के औसत के परिणामस्वरूप अपेक्षाकृत कम शोर(चित्रा 5B)हुआ, जबकि अन्य सेल से, केवल दो माप(चित्रा 5A)एकत्र किए जा सकते हैं। पर्याप्त मात्रा में डेटा एकत्र करने के अलावा, परिणामों का समय पर मूल्यांकन करना महत्वपूर्ण है, और शायद लेबलिंग रणनीति को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। प्रयोगों को डिजाइन करते समय, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि FRET संवेदनशील है, लेकिन 10 एनएम तक की दूरी तक सीमित है और अन्यथा “अंधा” है। हमारे मामले में, यह “अंधापन” अनछुए eGFP फ्लोरेसेंस लाइफटाइम (अनुपूरक नोट 5) द्वारा इंगित किया गया है। β2AR-IL3-eGFP-सीटी-स्नैप निर्माण(चित्रा 6A),FRET शमन eGFP आजीवन (अनुपूरक नोट 5) से इंगित किया जा सकता है । हालांकि, कोई एंटीकोरिएलेशन शब्द(चित्रा 6 बी)नहीं देखा जाता है, जिसका अर्थ है कि FRET या तो उतार-चढ़ाव नहीं है या प्रसार समय की तुलना में धीमी गति से समय पैमाने पर है। एसीएफजीपी, एसीएफआरपी,एसीएफ आरडी और सीसीएफ एफईआरटी (चित्रा 6 सी)में तीन अतिरिक्त छूट शर्तों की आवश्यकता होती है । एसीएफआरपी, एसीएफआरडी और सीसीएफएफईआरटी में धीमा घटक स्वीकार्य ब्लीचिंग के कारण हो सकता है और निश्चित रूप से, इन घटता में पाए जाने वाले धीमे प्रसार के प्राप्त मूल्य को प्रभावित करता है (एसीएफजीपीमें 117 एमएस की तुलना में ~ 350 एमएस)। लाल चैनल में टीडी को अलग आकार के कॉन्फोकल वॉल्यूम(चित्रा 2)के कारण हरे चैनल की तुलना में थोड़ा बड़ा माना जाता है – लेकिन केवल आकार के अंतर के बराबर कारक से। 3 माइक्रोस का बहुत तेज़ छूट का समयफ्लोरोफोरस13, 15,48के ट्रिपल निमिष को दर्शाता है, जबकि 37 माइक्रोन की धीमी छूट का समय एफईआरटी के कारण हो सकता है: इसी तरह, जैसा कि एफईआरटी सीसीएफएफईआरटीमें एक एंटीकॉरिएलेशन लाती है,31,32,33के स्वत: संबंधों में सकारात्मक सहसंबंधों की उम्मीद है। सीसीएफएफआरटी में “सकारात्मक” के रूप में इस शब्द की उपस्थिति और एसीएफआरडी में इसकी उपस्थिति को उच्च क्रॉसटॉक के साथ समझाया जा सकता है और इसे और स्पष्ट किया जाना चाहिए। ध्यान दें कि सीसीएफपाई अपेक्षा के अनुसार कम सहसंबंध समय पर सपाट है।
दूसरी ओर, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ब्याज की प्रणाली में FRET की घटना सहसंबंध घटता 6 पर गैर-रैखिक प्रभाव की ओरजाताहै। आणविक चमक जैसे, एक अणु तराजू के सहसंबंध आयाम चुकता और प्रत्येक FRET राज्य (और हमेशा एक सक्रिय रिसेप्टर के बिना वर्तमान अणुओं) में अलग आणविक चमक से पता चलता है । दरअसल, FRET हरे अणुओं का पता लगाया की स्पष्ट एकाग्रता कम हो जाती है (यानी, एसीएफजीपी आयाम बढ़ जाती है) और लाल अणुओं की संख्या (लाल-प्रॉम्प्ट से निर्धारित)5अधिक अनुमानित है। दोनों प्रभाव सीसीएफएफईआरटी और सीसीएफ पाई दोनों से प्राप्त बातचीत की मात्रा को प्रभावित करते हैं। हालांकि, वैश्विक विश्लेषण जैसा कि दिखाया गया है जैसे कि कैल्मोडुलिन 31, 32या सिंटैक्सिन33 की इंट्रामोॉलिकुलर गतिशीलता के लिए प्रोटीन गतिशीलता प्रकट कर सकता है। जब सावधानीपूर्वक कैलिब्रेट किया जाता है, तो सापेक्ष सीसीएफपाई और एसीएफ आयाम22से औसत एफआरटी दक्षता निकाली जा सकती है, जबकि सीमित राज्यों का निर्धारण दाता फ्लोरेसेंस लाइफटाइम डिस्ट्रीब्यूशन33के विश्लेषण से किया जा सकता है।
इस तथ्य को ध्यान में रखते हुए कि ईजीएफपी जैसे बड़े फ्लोरोफोरस के साथ लाइव सेल प्रयोगों में FRET कंट्रास्ट चित्र 6 में दिखाए गए सिमुलेशन के लिए ग्रहण की तुलना में भी कम होने की संभावना है और यह कि स्वीकारकर्ता की सीधी उत्तेजन सिमुलेशन में नहीं जोड़ी गई थी, यह समझा सकता है कि लाइव सेल प्रयोगों में एंटीकोरेशन की पहचान बहुत चुनौतीपूर्ण क्यों है। एक आशाजनक विश्लेषण विकल्प फोटॉन आगमन समय हिस्टोग्राम(चित्रा 1B)में एन्कोडेड जानकारी को संचयन करने पर निर्भर करता है, जो समय-सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती डेटा संग्रह29,30के कारण सुलभ है। यदि नमूने के अंदर दो (या अधिक) (FRET) प्रजातियों के फ्लोरेसेंस लाइफटाइम (~ पैटर्न) को जाना जाता है(चित्रा 7 ए),“फ़िल्टर” या वजन चुना जा सकता है जो सहसंबंधप्रक्रिया(चित्रा 7B)17,18, 19के दौरान लागू होते हैं। इस प्रकार सहसंबंध घटता प्राप्त होता है, अब पता लगाने वाले चैनलों के सहसंबंध का प्रतिनिधित्व नहीं करता बल्कि दो अलग-अलग (FRET) प्रजातियों के बीच ऑटो-या क्रॉस-सहसंबंध, इस प्रकार प्रजातियों-एसीएफ (एसएसीएफ) या प्रजातियों-सीसीएफ (एससीसीएफ) में बदल दिया गया है। मॉडरेट FRET कंट्रास्ट, हाई क्रॉसटॉक और ट्रिपल निमिष के साथ नकली डेटा के लिए इस दृष्टिकोण को लागू करने से एंटीकोरेलेशन शब्द(चित्रा 7C-D)ठीक हो जाता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि विश्राम समय प्राप्त किया जा सकता है लेकिन आयाम के लिए संबंध18खो दिया है । यह दृष्टिकोण पहले लाइव सेल प्रयोगों में लागू किया गया है जैसे ईजीएफआर की बातचीत का अध्ययन करने के लिए इसके विरोधी49 के साथ या असाधारण रूप से छोटे और लंबे फ्लोरेसेंस लाइफटाइम50के साथ ईजीएफपी वेरिएंट से जुड़े प्रोटीन से फ्लोरेसेंस को अलग करने के लिए।
जबकि शुद्ध प्रोटीन में पाई आधारित FRET माप काफी हद तक प्रोटीन गतिशीलता३६२२का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, जीवित कोशिकाओं में यह प्रोटीन प्रोटीन बातचीत को समझने पर केंद्रित है । यह दृष्टिकोण खमीर51 में एमएपी किनेज़ गतिविधि के विनियमन का अध्ययन करने या झिल्ली प्रोटीन की बातचीत को उनके साइटोसोलिक बाध्यकारी साथी के साथ हल करने के लिए लागू किया गया है जैसा कि इस हालिया अनुच्छेद52में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। यहां, जटिलताएं तब उत्पन्न हो सकती हैं जब ग्रीन फ्लोरोफोरस का महत्वपूर्ण क्रॉसटॉक अभी भी लाल चैनलों की देरी समय खिड़की या त्वरित समय खिड़की में हरे चैनलों में लाल संकेत में मौजूद है। पूर्व हरी नाड़ी के संबंध में लाल नाड़ी की अपर्याप्त देरी के कारण हो सकता है, जबकि दोनों प्रभाव भी दृढ़ता से अतिव्यापी उत्तेजन और चुने हुए फ्लोरोफोरस के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा से स्टेम होते हैं । झूठे-सकारात्मक सीसीएफपाई आयामों के लिए संबंधित एकल लेबल वाले निर्माणों को ध्यान से और सही करने की सिफारिश की जाती है, विशेष रूप से कोशिकाओं में जहां बहुत कम फ्लोरेसेंस लाइफटाइम के साथ ऑटोफ्लोरेसेंस एक और जटिल कारक हो सकता है22।
समाप्त करने के लिए, यहां वर्णित FRET-FCS दृष्टिकोण में निकट शारीरिक सांद्रता पर जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और प्रोटीन गतिशीलता को समझने की अपार क्षमता है। इस प्रोटोकॉल में, लाइव सेल माप के दौरान आवश्यक अंशांकन माप और आवश्यक मात्रात्मक विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित किया गया था। इस उद्देश्य के लिए, सिमुलेशन के साथ विभिन्न लाइव सेल माप दिखाए गए थे। सिमुलेशन यहां सामान्य समझ प्रदान करते हैं क्योंकि पैरामीटर को अनुरूप फिट मॉडल के साथ व्यवस्थित रूप से भिन्न किया जा सकता है जो संबंधित डेटा के विशिष्ट गतिशीलता और फोटोफिजिकल गुणों का वर्णन करते हैं। विश्लेषण एक व्यापक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल और आसान-से-अनुकूलन टेम्पलेट्स के साथ ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर टूल के साथ किया गया था। अंत में, तकनीकी प्रगति, और इस प्रकार डेटा विश्लेषण के लिए ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर के प्रसार के साथ-साथ तैयार-टू-बाय स्थिर पाई-एफसीएस सिस्टम की उपलब्धता इस तकनीक को एक बड़े अनुसंधान समुदाय के लिए अधिक से अधिक सुलभ बना देगी ताकि अंततः उच्चतम संवेदनशीलता के साथ जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन इंटरैक्शन और गतिशीलता को सुलझाया जा सके।
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना को ड्यूश फोर्स्चुंग्सजेमीसचैफ्ट (एसएफबी/टीआर २४०, परियोजना संख्या 374031971, परियोजना आईएनएफ) द्वारा जे.B और केजीएच को समर्थन दिया गया था ।
हम तकनीकी सहायता के लिए वित्तीय सहायता और कोर यूनिट फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए रुडोल्फ विर्को सेंटर का शुक्रिया अदा करते हैं। इसके अतिरिक्त, हम अश्विन बालाकृष्णन को पूरी तरह से सबूत पढ़ने के लिए धन्यवाद देते हैं ।
1x Telescope in 4f configuration with five lenses | Qioptiq, Rhyl, UK | G063126000 | Optics |
2x Band pass filters Brightline | AHF, Tübingen, Germany | HC 525/50 and HC 600/52 | Filter |
2x Dichroic beam splitter | AHF, Tübingen, Germany | HC BS F38-573 | Filter |
6-well culture plate Nunc | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 140675 | Reagent |
Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard) | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A20000 | Reagent |
Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard) | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A20003 | Reagent |
ASI stage PZ-2000 XYZ | Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany | WK-XYB-PZ-IX71 | Microscope Parts |
Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for 25 mm round coverslips | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A7816 | Glass coverslip holder |
Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14) | Laser Components GmbH, Olching, Germany | SPCM-AQR-14 | Single photon counting detector |
Beamsplitter | Newport, Darmstadt, Germany | 10FC16PB.3 | Filter |
Biorender (Software) | Science Suite Inc – o/a BioRender (Toronto, Canada) | — | Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/ |
Chinese hamster ovary (CHO) cell line | ATCC | CCL-61 | Cell lines |
ChiSurf (Data analysis Software) | Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA | — | tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017) |
Chloroform | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 472476-2.5L | Reagent |
DMSO | AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany) | A3672,0250 | Reagent |
DNA strand (40 bp fluorophore distance) | IBA Lifesciences GmbH (Göttingen, Germany) | — | Reagent, 5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’ |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | P04-41250, P04-41650 | Reagent |
Ethanol (absolute) | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 34852-1L-M | Reagent |
Erythrosin B,Dye content >=95 % | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 200964-5G | Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S 0615 | Reagent |
Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q | Excelitas Technologies, Ontario, Canada | XI120-Q-5060 | Microscope Parts |
Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR | New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) | S9105S | Reagent |
Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549 | New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) | S9112S | Reagent |
Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 – 0.16 mm) | Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) | 111640 | Reagent |
Laser Controller | Picoquant, Berlin, Germany | 910020 (PDL 828-S "SEPIA II") | Optics |
Laser lines (480 nm and 560 nm) | Picoquant, Berlin, Germany | 912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560) | Optics |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 11668-019 | Reagent |
MFD suite (Software) | AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany | — | Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis |
Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm | Thorlabs, Bergkirchen, Germany | AC254-150-A-ML | Second part of Beam expander |
Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm) | Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) | 640110 | Reagent |
Olympus IX 71 stand | Olympus, Hamburg, Germany | IX2-ILL100 | Microscope Parts |
Opti-MEM (Reduced-Serum Medium) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 31985-047 | Reagent |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 049M4857V | Reagent |
Phosphate-buffered Saline (PBS) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 14190144 | Reagent |
Pinhole (50 µM) | Newport, Darmstadt, Germany | PNH-50 | Pinhole |
PMT Hybrid-40 | Picoquant, Berlin, Germany | 932200 (PMA Hybrid 40) | Single photon counting detector |
Python scripts (Software) | Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany | — | Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS |
Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1) | AHF, Tübingen, Germany | F73-421PH | Filter |
Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator | Picoquant, Berlin, Germany | 02126 | Optics |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 6771.1 | Reagent |
SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software) | Picoquant, Berlin, Germany | 931073 (SPT64-1+2 single user ) | Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export |
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400 | Picoquant, Berlin, Germany | 930010 (Hydraharp 400) | Optics |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | T4299-100ml | Reagent |
Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 – 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm | Thorlabs, Bergkirchen, Germany | ACN127-020-A | First part of Beam expander |
Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W) | Olympus, Hamburg, Germany | UPLSAPO60XW | Objective |