Sviluppo di un laboratorio mobile di fisiologia mitocondriale per la misura dell'energetica mitocondriale sul campo
Summary
Abbiamo progettato e costruito un laboratorio mobile per misurare la frequenza respiratoria nei mitocondri isolati di animali selvatici catturati sul campo. Qui descriviamo la progettazione e l’allestimento di un laboratorio mitocondriale mobile e i protocolli di laboratorio associati.
Abstract
L’energetica mitocondriale è un tema centrale nella biochimica e nella fisiologia animale, con i ricercatori che utilizzano la respirazione mitocondriale come metrica per studiare la capacità metabolica. Per ottenere le misure della respirazione mitocondriale, è necessario utilizzare campioni biologici freschi e completare l’intera procedura di laboratorio entro circa 2 ore. Inoltre, per eseguire questi test di laboratorio sono necessarie più apparecchiature specializzate. Ciò crea una sfida per la misurazione della respirazione mitocondriale nei tessuti degli animali selvatici che vivono lontano dai laboratori di fisiologia, poiché i tessuti vivi non possono essere conservati per molto tempo dopo la raccolta sul campo. Inoltre, il trasporto di animali vivi su lunghe distanze induce stress, che può alterare l’energia mitocondriale.
Questo manoscritto presenta il MitoMobile dell’Università di Auburn (AU), un laboratorio mobile di fisiologia mitocondriale che può essere portato sul campo e utilizzato in loco per misurare il metabolismo mitocondriale nei tessuti raccolti da animali selvatici. Vengono presentate le caratteristiche di base del laboratorio mobile e i metodi passo-passo per misurare la frequenza respiratoria mitocondriale isolata. Inoltre, i dati presentati convalidano il successo dell’allestimento del laboratorio mobile di fisiologia mitocondriale e dell’esecuzione di misurazioni della respirazione mitocondriale. La novità del laboratorio mobile sta nella possibilità di recarsi sul campo ed eseguire misurazioni mitocondriali sui tessuti degli animali catturati in loco.
Introduction
Fino ad oggi, gli studi progettati per misurare l’energetica mitocondriale sono stati limitati ad animali da laboratorio o animali catturati vicino a laboratori di fisiologia stabiliti, il che ha precluso agli scienziati di eseguire studi bioenergetici mitocondriali in tessuti raccolti da animali durante attività come la migrazione, l’immersione e l’ibernazione 1,2,3,4,5,6 . Mentre molti ricercatori hanno misurato con successo i tassi metabolici basali e di picco e il dispendio energetico giornaliero degli animali selvatici7,8, la capacità dei ricercatori di misurare le prestazioni dei mitocondri è rimasta limitata (ma vedi 1,4,9). Ciò è in parte dovuto alla necessità di tessuto fresco per isolare i mitocondri e di una struttura di laboratorio per eseguire gli isolamenti entro circa 2 ore dall’ottenimento del tessuto fresco. Una volta che i mitocondri sono stati isolati, anche le misurazioni della respirazione mitocondriale devono essere completate entro ~1 ora.
Le frequenze di respirazione mitocondriale isolate vengono solitamente eseguite misurando la concentrazione di ossigeno in un contenitore sigillato collegato a un elettrodo di Clark. La teoria alla base di questo metodo si basa sull’osservazione di base che l’ossigeno è l’ultimo accettore di elettroni della respirazione mitocondriale durante la fosforilazione ossidativa. Pertanto, quando la concentrazione di ossigeno diminuisce durante un esperimento, si presume che si verifichi la produzione di adenosina trifosfato (ATP)10. L’ossigeno consumato è un indicatore dell’ATP prodotto. I ricercatori possono creare condizioni sperimentali specifiche utilizzando diversi substrati e avviare la respirazione stimolata dall’adenosina difosfato (ADP) (stato 3) aggiungendo quantità predeterminate di ADP alla camera. A seguito della fosforilazione dell’ADP esogeno in ATP, il tasso di consumo di ossigeno diminuisce e lo stato 4 viene raggiunto e può essere misurato. Inoltre, l’aggiunta di inibitori specifici consente di ottenere informazioni sulla respirazione a dispersione e sulla respirazione disaccoppiata10. Il rapporto tra lo stato 3 e lo stato 4 determina il rapporto di controllo respiratorio (RCR), che è l’indicatore dell’accoppiamento mitocondriale complessivo10,11. Valori più bassi di RCR indicano una disfunzione mitocondriale complessiva, mentre valori più alti di RCR suggeriscono una maggiore estensione dell’accoppiamento mitocondriale10.
Come affermato in precedenza, la raccolta del materiale biologico, l’isolamento mitocondriale e la misurazione della frequenza respiratoria devono essere completati entro 2 ore dal prelievo del tessuto. Per svolgere questo compito senza trasportare gli animali su grandi distanze verso laboratori consolidati, è stato costruito un laboratorio mobile di fisiologia mitocondriale da portare in luoghi sul campo dove questi dati possono essere raccolti. Un veicolo ricreativo Jayco Redhawk del 2018 è stato convertito in un laboratorio mobile di fisiologia molecolare e chiamato Auburn University (AU) MitoMobile (Figura 1A). Un veicolo ricreativo è stato selezionato per il frigorifero incorporato, il congelatore, il serbatoio di stoccaggio dell’acqua e l’impianto idraulico, l’elettricità alimentata da batterie da 12 volt, il generatore di gas, il serbatoio di propano e il sistema di autolivellamento. Inoltre, il veicolo ricreativo offre la possibilità di rimanere in siti remoti durante la notte per la raccolta dei dati. La parte anteriore del veicolo non è stata alterata e fornisce la zona guida e la zona notte (Figura 1B). I servizi della camera da letto precedentemente installati (letto, TV e armadio) nella parte posteriore del veicolo e nel piano cottura sono stati rimossi.
Al posto dei servizi della camera da letto e del piano cottura sono state installate scaffalature in acciaio inossidabile su misura e un piano di lavoro in quarzo personalizzato supportato da un’intelaiatura in alluminio 80/20 (Figura 1C). I banchi del laboratorio offrono uno spazio adeguato per la raccolta dei dati (Figura 1D). È stato preso in considerazione il consumo energetico di ogni apparecchiatura (ad esempio, centrifuga refrigerata, camere di respirazione mitocondriale, lettori di piastre, computer, omogeneizzatori, bilance, ultra-congelatore portatile e altre forniture di laboratorio generali). Per supportare le grandi richieste di tensione e corrente della centrifuga, il sistema elettrico è stato aggiornato a quello di apparecchiature di livello aeronautico. Un vano esterno nella parte posteriore del veicolo è stato convertito in una baia di stoccaggio dell’azoto liquido, che soddisfa le linee guida del Dipartimento dei trasporti degli Stati Uniti per lo stoccaggio e il trasporto di azoto liquido. Questa unità di stoccaggio è stata costruita in acciaio inossidabile e ha un’adeguata ventilazione per evitare che l’azoto gassoso in espansione fuoriesca nell’abitacolo del veicolo.
Per confermare che il laboratorio mobile può essere utilizzato negli studi bioenergetici mitocondriali, sono stati isolati i mitocondri e sono stati misurati i tassi di respirazione mitocondriale del muscolo scheletrico degli arti posteriori di topi domestici di derivazione selvatica (Mus musculus). Poiché Mus musculus è un organismo modello, i tassi di respirazione mitocondriale di questa specie sono ben stabiliti12,13,14. Sebbene studi precedenti abbiano documentato l’isolamento mitocondriale tramite centrifugazione differenziale15,16,17, di seguito viene descritta una breve panoramica dei metodi utilizzati nei metodi di laboratorio di fisiologia mitocondriale mobile.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il laboratorio mobile di fisiologia mitocondriale consente ai ricercatori di isolare i mitocondri e misurare i tassi di respirazione mitocondriale entro 2 ore dalla raccolta dei tessuti in siti remoti. I risultati qui presentati suggeriscono che le misurazioni della respirazione mitocondriale effettuate nell’AU MitoMobile sono paragonabili alle misurazioni effettuate in un laboratorio di ricerca universitario. In particolare, i valori per lo stato 3, lo stato 4 e l’RCR per Mus musculus di derivazione selvatica q…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Mark Nelms e John Tennant del dipartimento di ingegneria elettrica e informatica del Samuel Ginn College of Engineering dell’Università di Auburn per aver contribuito all’allestimento strutturale ed elettrico dell’AU MitoMobile. Inoltre, gli autori riconoscono il finanziamento per attrezzare l’AU MitoMobile e la ricerca da una sovvenzione dell’Auburn University Presidential Awards for Interdisciplinary Research (PAIR).
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products –> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
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