Abbiamo progettato e costruito un laboratorio mobile per misurare la frequenza respiratoria nei mitocondri isolati di animali selvatici catturati sul campo. Qui descriviamo la progettazione e l'allestimento di un laboratorio mitocondriale mobile e i protocolli di laboratorio associati.
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Articolo metodologico
Sviluppo di un laboratorio mobile di fisiologia mitocondriale per la misura dell'energetica mitocondriale sul campo
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'energetica mitocondriale è un tema centrale nella biochimica e nella fisiologia animale, con i ricercatori che utilizzano la respirazione mitocondriale come metrica per studiare la capacità metabolica. Per ottenere le misure della respirazione mitocondriale, è necessario utilizzare campioni biologici freschi e completare l'intera procedura di laboratorio entro circa 2 ore. Inoltre, per eseguire questi test di laboratorio sono necessarie più apparecchiature specializzate. Ciò crea una sfida per la misurazione della respirazione mitocondriale nei tessuti degli animali selvatici che vivono lontano dai laboratori di fisiologia, poiché i tessuti vivi non possono essere conservati per molto tempo dopo la raccolta sul campo. Inoltre, il trasporto di animali vivi su lunghe distanze induce stress, che può alterare l'energia mitocondriale.
Questo manoscritto presenta il MitoMobile dell'Università di Auburn (AU), un laboratorio mobile di fisiologia mitocondriale che può essere portato sul campo e utilizzato in loco per misurare il metabolismo mitocondriale nei tessuti raccolti da animali selvatici. Vengono presentate le caratteristiche di base del laboratorio mobile e i metodi passo-passo per misurare la frequenza respiratoria mitocondriale isolata. Inoltre, i dati presentati convalidano il successo dell'allestimento del laboratorio mobile di fisiologia mitocondriale e dell'esecuzione di misurazioni della respirazione mitocondriale. La novità del laboratorio mobile sta nella possibilità di recarsi sul campo ed eseguire misurazioni mitocondriali sui tessuti degli animali catturati in loco.
Introduzione
Fino ad oggi, gli studi progettati per misurare l'energetica mitocondriale sono stati limitati ad animali da laboratorio o animali catturati vicino a laboratori di fisiologia stabiliti, il che ha precluso agli scienziati di eseguire studi bioenergetici mitocondriali in tessuti raccolti da animali durante attività come la migrazione, l'immersione e l'ibernazione 1,2,3,4,5,6 . Mentre molti ricercatori hanno misurato con successo i tassi metabolici basali e di picco e il disp....
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Protocollo
Le sezioni seguenti descrivono i metodi di laboratorio mitocondriale. Tutte le procedure di manipolazione degli animali e di raccolta dei tessuti sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Auburn (#2019-3582).
1. Descrizione dei buffer utilizzati per la raccolta dei dati
NOTA: Questi tamponi possono essere preparati in un laboratorio fisso e spostati nel laboratorio mobile prima della gita sul campo (se non diversamente specificato di seguito).
- Preparare il tampone di isolamento mitocondriale del muscolo scheletrico con albumina sierica bovina (B....
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Risultati
L'attuale manoscritto ha studiato la respirazione mitocondriale di Mus musculus di derivazione selvatica (n = 7, maschio = 5, femmina = 2; età = 1,30 ± 0,2 anni) in un laboratorio mobile di fisiologia mitocondriale (Figura 1). Per misurare la respirazione mitocondriale del muscolo scheletrico, l'intero arto posteriore, quindi il muscolo aerobico e anaerobico, è stato utilizzato per l'isolamento mitocondriale (Figura 2). Esempi di dati grezzi sulla respi.......
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Discussione
Il laboratorio mobile di fisiologia mitocondriale consente ai ricercatori di isolare i mitocondri e misurare i tassi di respirazione mitocondriale entro 2 ore dalla raccolta dei tessuti in siti remoti. I risultati qui presentati suggeriscono che le misurazioni della respirazione mitocondriale effettuate nell'AU MitoMobile sono paragonabili alle misurazioni effettuate in un laboratorio di ricerca universitario. In particolare, i valori per lo stato 3, lo stato 4 e l'RCR per Mus musculus di derivazione selvatica q.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Mark Nelms e John Tennant del dipartimento di ingegneria elettrica e informatica del Samuel Ginn College of Engineering dell'Università di Auburn per aver contribuito all'allestimento strutturale ed elettrico dell'AU MitoMobile. Inoltre, gli autori riconoscono il finanziamento per attrezzare l'AU MitoMobile e la ricerca da una sovvenzione dell'Auburn University Presidential Awards for Interdisciplinary Research (PAIR).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette da centrifuga da 1,7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Provette da centrifuga da 2,0 mL | VWR | 87003-298 | |
| Provette da centrifuga da 50 mL | VWR | 21009-681 | Provetta per centrifuga Nalgene Oak Ridge |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Piastra trasparente a 96 pozzetti | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Omogeneizzatore a boccia | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Carta | Incluso con Hansatech OxyGraph | ||
| Acido grasso libero BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucosio | VWR | BDH8005-500G | |
| Siringhe Hamilton Glutammate | VWR | A12919 | |
| VWR | 60373-985 | Gaslight Serie 1700 | |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | Nessun numero di catalogo, ma può essere trovato sotto Prodotti --> Unità di controllo elettrodi | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malato | VWR | 97062-140 | |
| Mannitolo | VWR | 97061-052 | |
| Membrana | inclusa con Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Poliziotto | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Cloruro di potassio (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Proteasi | VWR | 97062-366 | La tripsina è comunemente usata; tuttavia, possono essere utilizzate altre proteasi. |
| Acido piruvico | VWR | 97061-448 | |
| Ditionito di sodio | VWR | AA33381-22 | |
| Succinato | VWR | 89230-086 | |
| Saccarosio | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
Riferimenti
- Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
- Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K.
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Ristampe e permessi
